1.范围
本标准规定了婴幼儿食品和乳品中β-胡萝卜素的测定方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中β-胡萝卜素的测定。
2.规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
3.原理
试样经皂化后,使β-胡萝卜素完全变为游离态。用石油醚萃取后,反相色谱法分离,外标法定量。
4.试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 α-淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg。
4.2 无水硫酸钠(Na2SO4)。
4.3 抗坏血酸(C6H8O6)。
4.4 石油醚:沸程30℃～60℃。
4.5 甲醇(CH4O):色谱纯。
4.6 乙腈(C2H3N):色谱纯。
4.7 三氯甲烷(CHCl3):色谱纯。
4.8 正己烷(C6H14):色谱纯。
4.9 乙醇:体积分数为95%。
4.10 氢氧化钾溶液:称固体氢氧化钾250g,加入200mL水溶解。临用前配制。
4.11 β-胡萝卜素标准品。
4.12 β-胡萝卜素标准溶液。
4.12.1 β-胡萝卜素标准储备液(500μg/mL):准确称取β-胡萝卜素标准品(4.11)50mg(精确到0.1mg),用正己烷(4.8)定容至100mL棕色容量瓶中。
注:β-胡萝卜素标准储备液需要-10℃以下避光储存,使用期限不超过3个月。标准储备液用前需校正,具体操作见附录A。
4.12.2 β-胡萝卜素标准中间液(100μg/mL):从β-胡萝卜素标准储备液(4.12.1)中准确移取10.0mL溶液于50mL棕色容量瓶中,用正已烷(4.8)定容至刻度。
4.12.3 β-胡萝卜素标准工作液:从β-胡萝卜素标准中间液(4.12.2)中分别准确移取0.50、1.00、200、3.00、4.0mL溶液转入5个100mL棕色容量瓶中,用正己烷(4.8)定容至刻度,得到浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0μg/mL的系列标准工作液。
5.仪器和设备
5.1 高效液相色谱仪,带紫外检测器。
5.2 旋转蒸发器。
5.3 恒温磁力搅拌器:20℃～80℃。
5.4 离心机:转速≥5000转/分钟。
5.5 分析天平:感量为0.1mg。
5.6 氮吹仪。
5.7 培养箱:60℃±2℃。
6.分析步骤
6.1 试样处理
6.1.1 淀粉类试样
称取混合均匀的固体试样约5g或液体试样约50g(均精确至0.0001g)于250mL三角瓶中,加入1.0g抗坏血酸(4.3),固体试样需用50mL45℃～50℃的水溶解并混合均匀。加入1gα-淀粉酶(4.1),向三角瓶中充氮后盖上瓶塞,置60℃±2℃培养箱(5.7)内酶解30min。
6.1.2 非淀粉类试样
称取混合均匀的固体试样约10g或液体试样约50g(均精确至0.0001g),置于250mL三角瓶中,加入1.0g抗坏血酸(4.3),固体试样需用50mL45℃～50℃的水溶解并混合均匀。
6.2 待测液的制备
6.2.1 皂化:将100mL95%乙醇(4.9)加入到上述试样溶液中,混匀并加入25mL氢氧化钾溶液(4.10)混匀,放入磁力棒,充入氮气排出空气,盖上胶塞。将1000mL的烧杯中加入约300mL的水,将烧杯放在恒温磁力搅拌器(5.3)上,当水温控制在53℃±2℃时,将三角瓶放入烧杯中,磁力搅拌皂化约45min后,取出立刻冷却到室温。
6.2.2 提取:将皂化液全部转入500mL分液漏斗中,加入100mL石油醚(4.4),轻轻摇动,排气,盖好瓶塞,室温下震荡10min后静置分层,将水相转入另一分液漏斗中按上述方法进行第二次提取。合并有机相,用水洗至近中性。有机相通过无水硫酸钠(4.2)过滤脱水。滤液收入500mL烧瓶中,于
旋转蒸发器(5.2)上在40℃±2℃的充氮条件下蒸至近干(绝不允许蒸干)。用石油醚(4.4)溶解残渣并转移至10mL容量瓶中定容。
从上述容量瓶中准确移取2.0mL石油醚溶液于10mL螺盖试管中,在40℃±2℃氮吹仪(5.6)上吹干。向试管中加1.0mL正己烷(4.8),震荡溶解残渣。再将试管以不低于5000转/分钟的速度离心(5.4)10min,取出静置至室温后待测。
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