1.范围
本标准规定了一种采用高效液相色谱法同时测定大豆中磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇三种组分含量的方法。
本标准适用于含油大豆磷脂、脱油大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的测定。本标准不适用于大豆溶血磷脂酰胆碱及大豆溶血磷脂酰乙醇胺的测定。
本标准中磷脂酰胆碱的检测限为1.21×10-2mg/mL,磷脂酰乙醇胺的检出限为4.63×10-2mg/mL,磷脂酰肌醇的检出限为7.36×10-3mg/mL。
2.原理
用多元流动相等度洗脱分配与色谱柱两相中的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇组分,在固定相中滞留时
间不同，达到分离目的。紫外检测器在线检测流出组分,与标准系列比较定量。
3.试剂
3.1 正己烷：色谱纯。
3.2 异丙醇：色谱纯。
3.3 水:色谱纯。
3.4 冰醋酸:色谱纯。
3.5 1%冰醋酸溶液：1mL冰醋酸用色谱纯水定容到100mL。
3.6 磷脂酰胆碱：标准物质，纯度≥99%。
3.7 磷脂酰乙醇胺：标准物质，纯度≥99%。
3.8 磷脂酰肌醇：标准物质，纯度≥98%。
3.9 流动相:V(正己烷)+V(异丙醇)+V(1%冰醋酸溶液)=8+8+1。
注：所用的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇标样来源应与所测定的样品一致，如测定的样品为大豆磷脂时，上述三种标样应来源于大豆。
4.仪器与设备
4.1 分析天平:精度为0.0001g。
4.2 刻度吸管:0.5mL,1mL，5mL。
4.3 容量瓶:5mL,10mL,100mL。
4.4 量筒:100mL,500mL,1000mL。
4.5 氮气瓶
4.6 液相色谱仪,带进样系统、紫外检测器和数据处理器。
4.7 液相色谱柱：Si-60柱子,填料粒度为5μm。长度250mm,内径4.6mm。
注:柱子长度与直径可以依据实验条件做相应选择。
5.分析步骤
5.1 液相系统的平衡
进样分析前,用流动相平衡液相系统,控制流速为0.5mL/min,保证基线平稳,样品的保留时间稳定。
5.2 标准溶液的配制
精确称取约20mg磷脂酰胆碱、20mg磷脂酰乙醇胺与10mg磷脂酰肌醇,用V(正己烷)+V(异丙醇)+V(1%冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶剂溶解并定容到10mL,配制磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的混合标准溶液,使溶液中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇浓度分别为2mg/mL、2mg/mL、1mg/mL。准确吸取此溶液0.25mL、1.25mL、2.50mL、3.75mL,5.00mL,并用V(正己烷)+V(异丙醇)+V(1%冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶剂定容到5mL,使溶液中磷脂酰胆碱的*终浓度为0.1mg/mL～2.0mg/mL,磷脂酰乙醇胺的*终浓度为0.1mg/mL～2.0mg/mL,磷脂酰肌醇的*终浓度为0.05mg/mL～1.0mg/mL,低于-16℃保存备用,保存时注意容器口的密封。
注:假如标样为三氧甲烷或甲醇的溶液,必须将其中的溶剂用氮气小心吹干,再用流动相溶解定容。
5.3 标准工作曲线的制作
分别取不同浓度的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇混合标准溶液10μL注入液相色谱中。以样品各组分浓度为横坐标,各组分峰面积为纵坐标,分别绘制磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇三种组分的标准工作曲线。
5.4 样品前处理
测试样品应避光放在密闭和防潮的容器内,样品在使用前需充分混匀。
依据样品中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量,精确称取样品15mg～50mg,用V(正己烷)+V(异丙醇)+V(1%冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶剂溶解并定容至5mL,低于-16℃保存备用,保存时注意容器口的密封。
5.5 测定
5.5.1 色谱条件：Si60柱子,长250mm,内径4.6mm,填充物粒度5μm,流动相流速1mL/min,柱温30℃,紫外检测波长205mm。如果采用不同型号的Si柱,可通过调整流速,达到*佳工作状态。
5.5.2 进样:准确取经0.45μm微孔过滤的待测液10μL,注入液相色谱仪,比较待测液与标准样品的高效液相色谱(HPLC)图谱,取与标准样品HPLC图谱中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱相同时间的峰面积与标准工作曲线比较定量。对同一样品至少进行两次测定。
6.结果计算
试样中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰肌醇的含量以各组分的质量与试样原有质量的质量分数表示,其计算公式为：
X=c×5/m×100
X——样品中磷脂酰胆碱(或磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)的含量,单位为克每一百克(g/100g);
c——由磷脂酰胆碱(或磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)标准工作曲线上查出的试样测定液中磷脂酰胆碱(或磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);
5——样品的定容体积,单位为毫升(mL);
m——样品的总质量,单位为毫克(mg)。
如果两次测定的结果符合第7章中给定的重复性要求,则取两次测定的算术平均值作为结果,如果不符合重复性要求,需对同一样品重新进行两次测定。
7.重复性要求
同一个分析者使用同样的方法在同一个实验室内使用同样仪器设备对同一试样连续进行两次测定的结果相对偏差不得大于5%。
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