作者：菩提
编辑：测老哥
本人喜好微生物、生物学的程度和喜欢温柔美丽善良姑娘的程度不向上下。对微生物学的热情使得我在从事微生物基础检测的理论方面可能有所心得。
说明一下，我讲的方法是方法，也不是方法。如果有一个人智慧得到开启，就没白写吧。
这篇文章针对的人员主要是从事微生物学检验检测，需要接触到细菌、真菌培养、分离鉴定、划线分离以及计数报结果的的人员。
都说微生物检验，那么啥是微生物呢？把“微生物”三个字拆开来就明白了。
微生物的定义：肉眼看不见的微小的生物。
微生物包括：细菌、真菌、原生动物、藻类、病毒，朊病毒、立克次氏斯体等。我们检测主要接触到的是细菌、真菌里面的霉菌和酵母、病毒，水环境里面的还检测几个原生动物-寄生虫的卵。
延伸一下：以前还把放线菌单独提出来，分类老师提到时候会说“..细菌、真菌、放线菌?”，现在放线菌包含在细菌里。细菌呢又分古细菌，真细菌，我们现在检测的基本是真细菌。真菌里面主要研究的是霉菌和酵母，对于其他大如蘑菇什么的研究的少。
微生物里面只有细菌和真菌形成菌落，其他的不能形成菌落。所以微生物学里面用到培养基这种形成菌落的间接检测方法只能检测细菌、霉菌和酵母。
我今天讲的就是这部分。
这里的标准方法非常狭义，只指检测细菌、霉菌和酵母等的方法。因为这部分用到的是微生物学里面*基础的知识。
这一部分标准加一起，也能摞很厚，国内的、国外的、进出口的、环境的、食品的、化妆品的。但从学过微生物学这么课程的人而言，其根本方法只有4-6个。需要掌握的方面不足10个，了解了就一通百通了。
为什么会这样呢？这就要理顺一下微生物学和检测方法的关系：先发现了细菌，后有了微生物学这门科学，然后应用到各行各业（当然应用是说检测，要说利用微生物的话，我们老祖宗在没微生物学的古时候早就会利用了），一方面可以保证食品安全，也可以了解产品里面卫生状况等。作为检测质量的一个手段。
新人突然接触标准，可能会手足无措，只能一个标准一个标准的去测。不懂原理也不敢改动，结果出来也不会处理和分析。没有太多的微生物的知识，所以更谈不上融汇了。所以我丢出一块砖，教大家怎么去学微生物以及怎么去对待标准。学习了根本方法，就不会被标准牵着，学个百人敌吧。
1、微生物检测，分定量和定性。
定性从本质上看，是一种定量。仔细对照标准，定量方法里面抽出一根来，从流程上看就是定性了。所以定量定性就被你学到一起去了。
那么从学科上呢，要掌握的知识有：微生物学，分子生物学，免疫学。
我只说微生物的。其他二类留给后来人。
2、微生物检测项目，概况起来就2类：
一、卫生指标（细菌总数、真菌总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌等）。
二、各种食源性的致病菌（沙门、志贺，副溶血，耶尔森氏菌，金黄葡，产气荚膜梭菌，单增、乳酸菌等等。
卫生指标是啥意思？指示菌。就像红绿灯。比如菌落总数，数大，说明产品卫生状况不好，含了太多菌。没有菌，说明产品质量不错，能放很久。
从逻辑上讲：
——菌落总数里面测出来没菌，那么99%的概率没有致病菌了（有人要问刚才说菌落总数里面提到了99%没有致病菌，还有1%呢？因为是间接方法有可能测不出来啊。达到方法*限了。微生物学方法不能保证****抓到细菌的。）。
——菌落总数多呢？对不起，有可能里面有致病菌！也可能没有。没有能松口气了吗？不能，因为没有致病菌只说明食品是相对安全的，吃了不中毒。但会腐败变质啊，质量就完了。这就是菌落总数的指示作用。针对的不是某一个菌，而是一个范围。
——同理总大肠、耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌也是这个道理。只不过是研究的受肠道菌污染的可能性以及受近期污染还是污染的比较久远了。
致病菌就简单多了，致病菌的方法就是针对某种或某属下菌的特点然后针对性的开发出来的方法。
微生物学检测过程主要包括：取样、样品处理及稀释、把样品加到培养基里，培养，计数报结果或后续验证然后计数报结果，定量报数，定性报有是没有（专业词汇叫检出/未检出）。
1、取样
取样很复杂，产品有多么五花八门，取样就多么纷繁复杂。要研究产品特性的，这里讲不完。总结一下重要就是：
取样要有代表性。取样不能污染。取样很重要。
不然后面测得再好，结果不能反应实际产品里真实情况，也白搭。
这个责任很重，重到什么程度？第三方检测会写上“只对来样负责”，意思就是厂家你取样你负责，我不清楚你咋取的，我无法负责。挺合理吧？呵呵。
2、样品处理及稀释
取样和样品处理分不开，所以这里的样品处理主要说的是把样品打散，比如食品25g样品加入225mL然后均质器拍打1分钟~2分钟弄匀了等。样品处理也是个大工程。具体问题具体分析把。稀释主要采用十倍梯度稀释法稀释样品。
3、把样品加到培养基里面，做成管子或平板
这里会讲3个方法。固体培养基里有2个方法：混菌倾注平板法，稀释涂布法，液体培养方法有：MPN法或叫多管发酵法
4、放培养箱里培养
培养就相当于饲养，实验员其实就是饲养员。只不过别人养猫养狗你养细菌等。细菌放细菌培养箱里，真菌放真菌培养箱里。看似废话，实则有大道。下面讲一下大道。
话说细菌和真菌分道扬镳，成立了2个界。界是啥呢？界、门、纲、目、科、属、种，是分类学上用来划分范围和从属关系归属关系的分类单位。亲疏远近都在分类树上。是生物分类的基本单位。“种”估计大家都明白吧，人有人种，狗有狗种，再往上就到属了，然后科啊等。界呢就是*大的一个分类单位，也就是一个范围。细菌一个大圈圈，叫细菌界，真菌一个大圈圈，叫真菌界。这界和动物界、植物界并列的。可见范围很广吧。
细菌菌落长的滑溜溜（也有不滑的，不能咬文嚼字啊），霉菌长得毛乎乎，酵母和细菌滑溜溜一样，但酵母在显微镜下很有特点，椭圆的，比细菌大，是细菌的10-100倍吧，所以显微镜下一眼就看出来是不是酵母了。细菌呢不产孢子（虽然产芽孢），真菌产孢子，孢子是繁殖体。就是孢子是真菌的儿子，孢子很轻，可以随风轻舞飞扬，而且真菌多子多福，有多多？有兴趣的可以看一下有篇文章叫“孢子的奇妙之旅”就知道了。
真菌孢子乱飞，遇到适宜的温湿度就开始长真菌，这就比较恐怖了，环境污染啊。一旦繁殖了多了，房间里面到处都是不好消毒杀死，反正就是处理起来很麻烦。为了减少麻烦和交叉污染，就要把细菌的房间和真菌的房间隔离，培养箱也不能用同一个。这一点学过微生物的很清楚其中的厉害关系，对于没基础的可能无知者无畏吧，在此告诫大家一定要分开哦。
5、培养完了，拿去数数或验证。
验证的方法原理除了前面几个方法，还用到另外一个方法：平板划线分离。下面就重点介绍这几个方法。
1、样品稀释的基本方法：十倍梯度稀释法
微生物数量是用个，十，百、千、万、?,亿来计算的，所以我们要选择方便、较少稀释数量、能满足要求的管数做实验。10倍一档，好算好取，适合不爱动脑的人。试想一下，单位体积里一万个菌你要稀释到100个菌，用2倍，3倍，4倍，5倍呢，光算水、样品的毫升数就搞蒙。10倍的呢，2根管子就完事。你也许说你数学不错，计算没问题。那我告诉你另外一个原因，细菌测不准。
微生物检测方法是个间接方法。由于细菌和细菌之间，和培养基之间有各种关系，还受环境影响，所以你测的结果除了实验室的原因外，也还是不能非常准确的反应样品里的真实数量。所以测不太准。
2、微生物检测方法之：混菌倾注平板法
有时也叫倾倒法，混菌法等，不管叫什么吧，你只要知道是按照下面过程进行的就行：把1mL样品加入平皿，再倾注15-20mL的培养基，混匀，静置冷却，平板凝固。
刚才说了细菌测不准，现在头脑风暴一下，细菌—细菌—培养基之间的关系。
细菌是活的，都要吃饭，培养基就是饭，一个菌在培养基里吃饭，吃完生儿子，一个变2个，按照2*2*2,?这样下去，2的指数次方增殖。固体培养基呢？卡着细菌，跑不太远，*后就上亿的菌堆在一起。形成一坨，一亿个呢，眼睛就能看见了。所以我们就叫这一坨为：一个菌落形成单位（根据英文翻译过来的），英文缩写用CFU表示，也当单位使。
——举例，100CFU/g，就是1克样品里的100个菌在吃饱饭后通过繁殖*后形成了100个大大小小的菌落，我们通过看到的菌落然后反推回去说样品里面有100个菌。所以有时你会看到有些标准上面写100个/g，那你会明白是100个菌落而不是100个菌，也就不会再用100个/g了。
例子举完了，我们继续讲细菌相互之间以及细菌和培养基之间的关系。
——培养基上只有一个菌*后形成一个菌落，都是自己儿子们，结果反正我们能看到这一个菌，所以也就不受菌-菌影响。
——不只有一个菌啊，有2个，3个，10个100个呢？离得远，相安无事，毕竟平板相对细菌，很大很大了。
——甄子丹说：我要打100个，培养皿说，给我倒1000个菌。坏了，这下就出问题了。空间有限，细菌之间相互打架（竞争关系，还有其他很多复杂的关系就不展开了，反正是不好的关系），制造点抑制剂啥的让其他菌不长，再就是个子大占地方大。铺满整张床。所以90mm的大床只够形成容纳300个菌落。再多长不出来了。1000个菌只形成了300个CFU，是不是就不准了。所以呢，现在就明白了：
为什么菌落总数计数时候要求选择30-300这个范围。不然就不准了呀。
现在又要开悟了。
——所有的培养基上面都是规定的30-300吗？当然不是，真菌就是10-150（GB 4789.15-2016），因为真菌菌落个子大，占床位多一点。300就不好计数了，不信你去1皿里面培养300个霉菌数数。
——那么大肠埃希氏菌（见GB 4789.38-2012）检测为啥要10-100呢？因为大肠的培养基里面有选择性抑制剂，这些规定是前人科学家通过模式统计*后发现这个范围结果*接近样品里面真实情况。
要是有喜欢继续问的，又会问。不在30-300里面咋弄呢？这就需要分情况说明了。
——超过300咋办呢？简单啊，按照前面说的“十倍梯度稀释”，选择“合适稀释度”啊。
所以“合适稀释度”这个词适合老玩家，不适合新手，对于新手应该像我上面这样再给她啰嗦解释一番，让他稀释到长出来在30-300之间的拿去计数。
大于300的解释完了，再解释一下小于30的。
——小于30说明样品里菌相对较少，一共就这么多了。如果有多个稀释度，其中稀释过了，检不出菌，就往高浓度测测，所以液体样品一般要求从原液开始。固体样品没有原液，那就稀释稀释10倍咯。
——要是菌落数量小到全没有。是否就万事大吉了呢？这肯定释放的是一个好的消息，至少说明菌很少。但也不能轻视。因为实验是反推，就有逻辑上的思考：一个细菌能长出一个菌落，一个菌落能知道样品里面肯定有一个菌（菌不会无中生有，是需要种传代的，是活的生物。）；但没有形成菌落不能说没有菌，也有有可能没长啊。所以释放了2个信息：这个方法到头了，按照这个方法可以报未检出或小于1或小于10了。
——如果还想测，那就换更好的工具，比如滤膜法啊，比如MPN法。滤膜法是浓缩的方法，MPN法是灵敏度更高的方法，当然每个方法都有他们自身的缺点。
3、微生物检测方法之：MPN法,也叫多管发酵法
多管发酵法是根据泊松分布律做出来的。这个讲起来有点复杂，公式我也就不编辑了，想要弄明白泊松分布律，要学习大学的概率论和数理统计，要学概率论和数理统计就要学高等数学（微分和积分）。如果大学的忘光或压根没学过，也不怕，从高中学起。人大A版（或B版）数学还是很不错的。而且有电子版，自己找找就可以学习。
如果忙到喝水撒尿都没时间的话，也不想废那个脑子，那就机械照搬吧。因为伟大的科学家们早就想到了我们搞不定，早就制好了葵花宝典。把泊松分布的公式直接一个一个算出来了，编制成了MPN表。
那我们就只需要照表去执行就行。干讲难懂，那就举例吧。
举例：100CFU/mL的样品原液，我们拿来做MPN，怎么弄呢？
先按十倍梯度稀释把样品匀液弄好。稀释3个稀释度，加上原液就有了：10的0,12,3次方,计四个稀释度，然后我们按照9管法（还有其他数量的管法，原理相通），加样，如图：
原液1mL进10mL的管子，3支，其他相同。分别加好后，我们就等于把菌分下去了。10的0次管子里是100个菌，培养后。看到菌了。管子就记录为1，看不到菌就记录为0，所以分下去的 菌个数是（100，100,100）：（10,10,10）：（1,1,1）（1,0,0）*后的100是把0.1个菌进一法认为至少有一个菌的情况来估算的，也可以估算为没有。那么我们对应的MPN结果呢，就是3:3:3:1
从这里不难看出，如果你的菌太大，比如1000个，那么你前面三个管子就没啥意义，因为都能接到菌。这也就是为什么MPN为啥对100CFU/mL“浓度”以下的菌才更好使的缘故。
方法是这么做，但MPN还有它的难点。很有必要解释一下。
我这个图是理想状态，也就是100个菌都非常均匀了，那么实际情况不会这么匀，就会出现3332,3330,3320等情况，也都是合理的，所以呢MPN的结果虽然是个概率但是一个比较宽的概率范围，就是很不准！
也就提到了MPN名字的意思，MPN翻译过来叫*大可能数（也能叫或然系数），这是一个概率事件，概率也就是说不准，“*大”只有一个，其他不*大的还有许多，后来MPN表后面就附带了95%的置信区间。也就是说你落在95%里面的数据从概率上来讲都是合理的，但实际情况是不是这样，不一定呢。
而我们平板计数法获得的结果呢？是一个确定的数据，也是事件，你做出来多少，是一个实数，就相当于已经铁板钉钉了。那MPN得到的结果呢？是不确定的，是个可能。
那么有时候有人问我，我100CFU/mL和100MPN/mL结果能互通吗？有关系吗？互通是不可能。有关系吗？有，但非常复杂，常人不是数学家，考虑不过来那么多因素，所以还是假装没有关系吧。既然是假装，那就不互通，也认为没有关系。有**有能力或别人有能力再去解决这个问题。
那么又有人问我了，那么1MPN/mL和1MPN/100mL有关系吗？有，100倍关系。
但这里有一个问题，MPN表不是按照100倍关系互通。因为1MPN/100mL的表是过去弄的，历史原因，表里面数字都被修成了整数（不能用现在人的观点去嘲笑原来制定方法的科学家们，因为历史是螺旋往前的，要去了解来龙去脉和理解我们的前辈的科学家们）。而新表是按照泊松率严格算出来的数据，有小数。所以表不能互用。等历史问题得到了清算，有**会是一样的。
4分离纯化的方法之：平板划线分离。
写的有点累了，直接贴我原来教别人的吧。
【用灼烧后接种环取一点菌苔或细菌悬液，在平板一侧边缘处，反复涂抹在直径约为1cm大小的面积上;灼烧接种环，冷却后，从上述涂菌处划出7、8条直线，前3、4条线从涂菌处划出，后3、4条可不通过涂菌处，划线时接种环与平板表面成30°、40°角（指手拿的环和皿平面），轻轻接触，不要使接种环划破表面;如上述烧灼、划线操作再重复数次，以划满整个平板为宜;倒置平板，于*适温度培养1、2天，出现单菌落即为纯化后的单一细菌。】
我们讲完了怎么做一套实验，也讲了几个重点的方法。那我们遇到新的检测微生物的标准的时候怎么办呢？这就需要把新知识融入旧方法里面。
1、我们可以近似认为：所有的平板计数法都和菌落总数一样。
各种检测致病菌的定量方法可以看成：【菌落总数】乘以【系数】。比如总大肠菌群，VRBA上面数出来的菌，那可以看出菌落总数，然后用BGLB去获得系数。
2、要了解，很多标准里面确证到*后都是求一个比例系数。
我们在一个平板上长出来菌，有好几种。为了验证这些菌是或不是，那就开始一系列生化方法了。试剂是钱啊，另外人力也不能全部都验证了。比如有100个菌。那我们就验证一部分。用来代替总体水平。这就是一个确地比例的方法，所以想要获得等比例放大、缩小，就需要注意：不同类型的都要挑取部分验证。平板法获取的是比例，所以要挑够个数，MPN是一根管子一个管子去验证，你一根管子如果划线分离出好几个菌，只要验证1个是，那么前面的MPN的管子里就算检出了。定性和MPN验的方式相似，有一个就检出了！
明白了这个道理在选择怎么获得结果时候就可以考虑人力、时间、和试剂贵贱的经济问题。
讲一下GB 4789.3-2016总大肠菌群让人模糊或容易出错的验证系数的地方。
平板用VRBA计数后，把菌分成典型和不典型，然后验证，如果只是一个平板，大家一般不会困扰：分别计数典型、不典型菌数，等到典型/非典型比例，10根管子按比例分配去挑菌验收。然后各算各的。
现在大肠菌群有2个平板（平行），有人就模糊了，有人直接把菌一平均，然后把10根管子按照1皿5管分下去了，这不科学。
*好的办法是，把2个平板看成一个整体，把各自的典型和不典型分计算出来然后算出比例再乘以10个根子，把10根管子分给典型和不典型，才合理。或者有**改了，告诉你典型用5根，不典型用5根，也别规定总数了。那样估计也好。
用少量菌来获取比例系数的方法在其他好几个实验里面也用到，比如铜绿，比如肠杆菌科，比如金黄葡，许多标准都用到，标准不会说，你要会看。
比例系数的优点节约了成本，缺点有可能漏检。所以高风险的实验尽量多挑菌来验证，比如沙门、单增李斯特氏菌（只是举2个例子，其他类推）至少挑多一些菌来验证（检出就不需要，同时也对划线分离提出了高要求，平时要多练习），检不出时候要承担更大风险所以要多验等。
3、所有菌落总数原理的定量计数结果单位都是浓度单位
计算过程按照浓度方式进行。很多人遇到菌落总数或其他计数标准里这个公式就蒙。
这个公式呢，写的复杂，并不难。你认为菌落总数是个浓度单位就好了。比如单位是CFU/mL，就是问你：1毫升样品原液里面有多少菌啊？那解决办法就是拆了推啊，举4个平板为例吧。
2个稀释度下有4个平板，10-1里面菌落总数226,228，10-2里面36,38，那么我们知道隐藏条件：每个皿都加了1mL样品。10-2里面的1mL呢可以则算到10-1里面的0.1mL,所以按照分母的话，就是2.2mL，总菌落呢？就全部一加（226+228+36+38），然后总菌落数乘以总体积，不就得到1mL里面多少菌了吗？因为算的是10-1里面的1mL的菌数，那么再把稀释度算上推回去就好了。
开始头脑风暴了。
——如果三个平板在范围内呢比如38变成了21呢？21不在规定的计数范围内，剔除。只留下3个皿计算就好了，分子还是总菌数（226+228+36）分母就变成了2.1mL咯。
——如果总菌落数不是真的总数呢，那就分别乘以比例系数后再去当分子啊。比如铜绿，只不过铜绿是过滤250mL水样，*后的单位是/250mL。所以分母就不需要变了。
4、计数方法里面看到倒平板就是倾注平板法、或者稀释涂布法。用到MPN管就是MPN法原理。
不管叫多管发酵法还是MPN法也不管是5管、12管、15管、20管等等都是同一个方法。抓住MPN表和稍有不同的关键点就好了。
5、生化实验前做的都是分离纯化，获得纯菌的过程逃不过平板划线分离。
不要侥幸，没有确定的纯菌后续的验证都是错的，错的，错的！而且菌种的传代、验收、保存都要用到。
微生物学是一门方法少、知识多的学科，理解力用的不多，记忆力用的多。这就是它门槛低的地方。许多知识你只需要记住你就看似会了。
所以为了做到“看似”，平时需要多积累知识，积累知识没有捷径，要用笨方法，积累各种菌或属或科的共同点，比如肠杆菌科是革兰氏阴性，氧化酶阴性这样的大方向信息。
有本书还不错，中国工业微生物菌种保藏管理中心出的标准菌种图谱，说它不错，因为它信息准确性高，不像百度那种不靠谱的知识。当然百度也是很好的。查资料时候货比三家再信吧，就算错了也没关系，错的总会在适当的时候被发现，然后加强了记忆。这就是辩证和禅吧。没有**。把上面的标准菌株的信息获取吸收。然后再去学一门基础的微生物学、生物化学、细胞生物学等课程吧，如果不愿意看书，可以问我要老师讲课的视频，超级通俗易懂，都能学会。
微生物学门槛低，不代表他很低级。微生物学属于大隐隐于市的学问。**你想啊，世界上微生物团体这么大，会那么轻易被看穿的吗？所以我们一方面要积累知识，总结啊归纳啊贯通啊，把各部分连贯起来，还要了解新知识，新手段，比如分子学手段啊，比如飞行时间质谱啊，比如梅里埃那啥啥设备，然后还要会运用到实践中去分析解决问题。
在检测标准方面，需要老实的按照对应的的标准去做实验，这是有一个框的问题，只能这么做。但在这个基础上，国标没通过的方法有时候也要借鉴，尤其西方新的方式方法。微生物我们暂时一段时间是超不过西方国家的，这是历史原因和国情和我们科学发展史有关的，但我们可以追啊。追呢不只是标准制定者、专家的事情。是每个人都可以学的事情。比如我们的单核细胞增生李斯特氏菌标准到了更新到2016年版本了，2017年 ISO 11290-1-2017更新了1和2本，其中很大一部分就是按照*新李斯特氏菌属的特点制定的方法。不学习可以吗？当然不可以，落后就要挨打。
我们虽然只是一个小小的检测员，要自信自强，虽然有时候我们的工资不高、老板也不一定重用你，但这有什么关系呢？要学禅啊，你的智慧你的能力就像你是一个细菌一样，终将破坏、或造福这个世界的。
而且我们检测人肩上的责任一点也不轻。微生物亦正亦邪，所以我们检测人员为了人民的生活质量，为了不让微生物的魔性祸乱人间，就要把好检测这一关，因为检测是事后诸葛亮，是*后一关了。
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