1.范围
本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌( Bacillus cereus)的检验方法。
本标准**法适用于蜡样芽胞杄菌含量较髙的食品中蜡样芽胞杄菌的计数;第二法适用于蜡样芽胞杄菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杄菌的计数。
2.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
a) 冰箱:2℃～5℃;
b) 恒温培养箱:30℃±1℃、36℃±1℃;
c) 均质器;
d) 电子天平:感量0.1g;
e) 无菌锥形瓶:100mL、500mL;
f) 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头;
g) 无菌平皿:直径90mm;
h) 无菌试管:18mm×180mm；
i) 显微镜:10倍～100倍(油镜)；
j) L涂布棒。
3.培养基和试剂
3.1 磷酸盐缓冲液(PBS):见附录A中A.1。
3.2 甘露醇卵黄多黏菌素(MYP)琼脂:见附录A中A.2。
3.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤:见附录A中A3。
3.4 营养琼脂:见附录A中A4。
3.5 过氧化氢溶液:见附录A中A.5。
3.6 动力培养基:见附录A中A.6。
3.7 硝酸盐肉汤:见附录A中A.7。
3.8 酪蛋白琼脂:见附录A中A8。
3.9 硫酸锰营养琼脂培养基:见附录A中A9。
3.10 0.5%碱性复红:见附录A中A.10。
3.11 动力培养基:见附录A中A.11。
3.12 糖发酵管:见附录A中A.12。
3.13 V-P培养基:见附录A中A.13。
3.14 胰酪胨大豆羊血(TSSB)琼脂:见附录A中A.14。
3.15 溶菌酶营养肉汤:见附录A中A.15。
3.16 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见附录A中A.16。
3.17 明胶培养基:见附录A中A.17。
4.蜡样芽胞杄菌平板计数法(**法)
4.1 检验程序
蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序见图1。
4.2 操作步骤
4.2.1 样品处理
冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻,若不能及时检验,应放于-10℃～-20℃保存;非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于2℃～5℃冰箱保存,24h内检验。
4.2.2 样品制备
称取样品25g,放入盛有225mL PBS或生理盐水的无菌均质杯内,用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打lmin～2min。若样品为液态,吸取25mL样品至盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀,作为1:10的样品匀液。
4.2.3 样品的稀释
吸取4.2.2中1:10的样品匀液1mL加到装有9 mL PBS或生理盐水的稀释管中,充分混匀制成1:100的样品匀液。跟据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递増系列稀释样品匀液。每递増稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。
4.2.4 样品接种
根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别移入三块MYP琼脂平板,然后用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如MYP琼脂平板表面有水珠,可放在25℃~50℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
4.2.5 分离、培养
4.2.5.1 分离
在通常情况下,涂布后,将平板静置10min。如样液不易吸收,可将平板放在培养箱30℃±1℃培养1h,等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,30℃±1℃培养24h±2h。如果菌落不典型,可继续培养24h±2h再观察。在MYP琼脂平板上,典型菌落为微粉红色(表示不发酵甘露醇),周围有白色至淡粉红色沉淀环(表示产卵磷脂酶)。
4.2.5.2 纯培养
从每个平板(符合44.1.1要求的平板)中挑取至少5个典型菌落(小于5个全选),分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养,30℃±l℃培养24h±2h,进行确证实验。在营养琼脂平板上,典型菌落为灰白色,偶有黄绿色,不透明,表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状,边缘常呈扩展状,直径为4mm～10mm。
4.3 确定鉴定
4.3.1 染色镜检
挑取纯培养的单个菌落,革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌,大小为(1μm～1.3μm)ⅹ(3μm～5μm),芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端,不膨大于菌体,菌体两端较平整,多呈短链或长链状排列。
4.3.2 生化鉴定
4.3.2.1 概述
挑取纯培养的单个菌落,进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、ⅴ-P试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。蜡样芽胞杆菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别见表1。
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