1.范围
本标准规定了食品中空肠弯曲菌( Campylobacter jejuni)的检验方法。
本标准适用于食品中空肠弯曲菌的检验。
2.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 恒温培养箱:25℃±1℃、36℃±1℃、42℃±1℃；
b) 冰箱:2℃～5℃
c) 恒温振荡培养箱:36℃±1℃、42℃±1℃;
d) 天平:感量0.1g；
e) 均质器与配套均质袋；
f) 振荡器;
g) 无菌吸管:1mL(具001m刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头；
h) 无菌锥形瓶:容量100mL、200mL、2000mL;
i) 无菌培养皿:直径90mm;
j) pH计或pH比色管或精密pH试纸；
k) 水浴装置:36℃±1℃、100℃;
l) 微需氧培养装置:提供微需氧条件(5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气);
m) 过滤装置及滤膜(0.22μm、0.45μm);
n) 显微镜:10倍~10倍,有相差功能;
o) 离心机:离心速度≥20000g;
p) 比浊仪;
q) 微生物生化鉴定系统。
3.培养基和试剂
3.1 Bolton肉汤( Bolton broth):见附录A中A.1。
3.2 改良CCD琼脂( modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar, cCDA):见附录A中A2。
3.3 哥伦比亚血琼脂( Columbia blood agar):见附录A中A3。
3.4 布氏肉汤( Brucella broth):见附录A中A4。
3.5 氧化酶试剂:见附录A中A.5。
3.6 马尿酸钠水解试剂:见附录A中A.6
3.7 Skirrow血琼脂( Skirrow blood agar):见附录A中A.7。
3.8 吲哚乙酸酯纸片:见附录A中A.8。
3.9 0.1%蛋白胨水:见附录A中A9。
3.10 lmol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液:见附录A中A.10。
3.11 3%过氧化氢(H2O2)溶液:见附录A中A.11。
3.12 空肠弯曲菌显色培养基。
3.13 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。
4.检验程序
空肠弯曲菌检验程序见图1。
5.操作步骤
5.1 样品处理
5.1.1 一般样品
取25g(mL)样品(水果、蔬菜、水产品为50g)加入盛有225 mL Bolton肉汤的有滤网的均质袋中(若为无滤网均质袋可使用无菌纱布过滤),用拍击式均质器均质1min~2min,经滤网或无菌纱布过滤,将滤过液进行培养。
5.1.2 整禽等样品
用200mL0.1%的蛋白胨水中充分冲洗样品的内外部,并振荡2min～3min,经无菌纱布过滤至250mL离心管中,16000g离心15min后弃去上清,用10mL0.1%蛋白胨水悬浮沉淀,吸取3mL于100mLBolton肉汤中进行培养。
5.1.3 贝类
取至少12个带壳样品,除去外壳后将所有内容物放到均质袋中,用拍击式均质器均质1min～2min,取25g样品至225mL Bolton肉汤中(1:10稀释),充分震荡后再转移25mL于225mL Bolton肉汤中(1:100稀释),将1:10和1:100稀释的 Bolton肉汤同时进行培养。
5.1.4 蛋黄液或蛋浆
取25g(mL)样品于125mL Bolton肉汤中并混匀(16稀释),再转移25mL于100mL Bolton肉汤中并混匀(1:30稀释),同时将1:6和1:30稀释的 Bolton肉汤进行培养。
5.1.5 鲜乳、冰淇淋、奶酪等
若为液体乳制品取50g;若为固体乳制品取50g加入盛有50mL0.1%蛋白胨水的有滤网均质袋中,用拍击式均质器均质15s~30s,保留过滤液。必要时调整pH值至7.5±0.2,将液体乳制品或滤过液以20000g离心30min后弃去上清,用l0mL Bolton肉汤悬浮沉淀(尽量避免带入油层),再转移至90mLBolton肉汤进行培养。
5.1.6 需表面涂拭检测的样品
无菌棉签擦拭检测样品的表面(面积至少100cm2以上),将棉签头剪落到100mL Bolton肉汤中进行培养。
5.1.7 水样
将4L的水(对于氯处理的水,在过滤前每升水中加入5mL Imol/L硫代硫酸钠溶液)经0.45μm滤膜过滤,把滤膜浸没在100 ml Bolton肉汤中进行培养。
5.2 预增菌与增菌
在微需氧条件下,36℃±1℃培养4h,如条件允许配以100r/min的速度进行振荡。必要时测定增菌液的pH值并调整至74±0.2,42℃±1℃继续培养24h～48h。
5.3 分离
将24h增菌液、48h增菌液及对应的1:50稀释液分别划线接种于 Skirrow血琼脂与 mCCDA琼脂平板上,微需氧条件下42℃±1℃培养24h～48h。另外可选择使用空肠弯曲菌显色平板作为补充。
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