如何检测饲料中的植物酶活性？

植物酶可以提高动物的消化功能，催化机体内的生化反应，促进机体的新陈代谢，从而弥补因应激等原因消化酶分泌的减少。所以很多时候，类似植酸酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、淀粉酶等植物酶制剂会被作为很好的饲料添加剂，应用在饲料产品的生产加工里面。这时候，如果企业能够准确的把握酶活性、酶反应的相关数据就能够更好的设计一款符合市场需求的畜禽饲料。

植物酶活性的检测可以使用分光光度法进行测定，这一点，可以依据我国国家标准GB/T 18634-2009《饲用植酸酶活性的测定 分光光度法》来进行测定。通过实验室分析手段来进行评价， 我们可以用来筛选酶制剂的优劣，了解植物酶的*适反应温度、*适反应pH,pH的稳定性、底物的浓度对酶活性检测的影响等数据，从而完全反映添加植物酶后饲料的真实使用效果。所以，本次检测方案基本参考GB/T 18634-2009给出的方法。

一、方法原理分析

使用分光光度法检测植酸酶活性，原理主要是利用植酸酶在一定温度和 pH 条件下，可以水解底物植酸钠，从而生成正磷酸和肌醇衍生物，只要在酸性溶液中，用钒钼酸氨处理，就会生成黄色的【（ NH4） 3PO 4 NH 4 VO 3 · 16M O O 3 】复合物，然后我们用分光光度计，在波长 415nm 下进行比色测定就可以了解其酶活性。

二、检测方法步骤

1.取有代表性样品， 用四分法将试样缩分至200g， 植酸酶产品不需粉碎， 配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛,装入密封容器,防止试样成分变化。

2.称取样品5000U/g的0.4~0.6g，精确至0.0001g，置于250mL三角瓶中，准确加入100mL乙酸缓冲液（2），放到空气浴摇床上振荡30min或磁力搅拌器上高速搅拌30min，在离心机上以4000r/min离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液（2）稀释，使样液浓度保持在0.4U/mL左右，待反应。建议精确移取上清液1mL至25mL容量瓶中，用乙酸缓冲液（2）定容，摇匀。再继续精确移取1mL试液至25mL容量瓶中，定容，摇匀，稀释至31250倍。

3.取10mL试管，精确移取2mL稀释液至试管中，同时做试样空白。将样品放入37℃水浴锅预热5min，先将空白加4mL终止液（1.3.7），再将样与空白依次加入4mL底物植酸钠（1.3.3），从加底物开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要**一致，加液后立即混匀，将其放入37℃水浴水解30min；取出后将样品各加入4mL终止液。

4.反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机（1.4.7）上以4000转/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零在分光光度计415nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，A-A0为实测吸光值，用直线回归方程计算植酸酶的活性。

三、酶反应分析

1.酶反应的*适温度

酶反应的*适温度调节恒温水浴锅，在不同温度下(15~70℃)进行酶促反应。以*高酶活为****，其他条件下的酶活占*高酶活的百分数即为该酶在此温度条件的相对酶活。植酸酶作为一种酶制剂，对温度非常敏感，温度低会降低它的生物活性；温度高也会降低其生物活性，甚至完全失活。植酸酶随着温度的增加，酶活呈上升趋势，到55℃左右酶活达到*高，温度超过55℃后酶活开始下降，通过检测，该酶的*适反应温度为55℃。

2.酶反应的*适pH值

配制0.1mol的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在不同的pH值((1.0~7.0)下进行酶促反应。以*高酶活为****，其他条件下的酶活占*高酶活的百分数即为该酶在此pH条件的相对酶活。通过检测可知，植酸酶的*适pH值在4.0左右。pH值在2.5~5.5，能保持70%以上的酶活，该酶有较宽的pH适宜范围，可以在消化道内充分发挥作用。

3.底物浓度对酶活的影响

配制不同反应浓度(0.1~5.0mmol/L)的底物，在常规条件下测定酶活，以*高酶活为****，在其他条件下的酶活，占*高酶活的百分数即为该酶在此底物浓度下的相对酶活。随着底物浓度的增加酶活逐渐上升，当底物浓度足够大时，酶全部被底物所饱和，此时反应速度达到*大值。随着底物浓度的增加，样品空白的本底值逐渐增大，会影响酶活的测定。

四、总结

通过分光光度计法检测，我们可以了解到该酶制剂样品的*适反应温度为 55℃；*适反应pH值为4.0。酶活的测定在饲料用酶制剂产品的质量检验、产品标签和酶活保证方面是必不可少的项目， 而酶活的测定是一种非常细致的工作，所以，我们一定要找准依据标准，深刻理解影响酶制剂酶活测定的主要因素，正确把握各影响因素的关键点，从而才能为企业筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的*佳组方及确定产品的*佳添加量等提供更好的数据支撑。

除了GB/T 18634-2009外，如果想检测其他植物酶活性，参考的标准还有 GB/T 23874-2009 《饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 》、 GB/T 28715-2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法》、 GB/T 33409-2016 《β-半乳糖苷酶活性检测方法 分光光度法》、 GB/T 23881-2009 《 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法》 等等，大家可酌情参考。