黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是一种常见的腐生真菌，多见于发霉的粮食、粮食制品及其它霉腐的有机物上，其主要存在形式为B1，B2，G1，G2。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1*为常见，其毒性和致癌性*强。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为一级致癌物，是一种毒性*强的剧毒物质[1]。研究表明，长期食用被黄曲霉毒素污染的食物将导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病，为了防止黄曲霉毒素危害人类健康，世界各国对黄曲霉毒素在食品中的残留限量做了严格的规定[2]。
黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫法和高效液相色谱法[3–5]。刘晓茂等[6]采用超高压液相色谱串联质谱法测定食用植物油中的黄曲霉毒素，该方法具有灵敏度高、选择性强和定量结果准确等优点，但仪器较为昂贵，使用成本高，很难普及应用，且净化过程繁琐，需要消耗大量有机溶剂。笔者采用Mycosep228AflaPat多功能净化柱处理样品，应用光化学衍生，结合高效液相色谱法同时测定牛奶中的黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2。该法具有操作简单、速度快、消耗溶剂少等优点，为实验室开展黄曲霉毒素的检测提供参考方法。
1实验部分
1.1主要仪器与试剂
高效液相色谱仪：Waterse2695型，主要包括2475荧光检测器、柱温箱、自动进样器、自动脱气四元梯度泵等，美国Waters公司;光化学衍生器：HM11104型，北京华安麦科生物技术有限公司;氮气吹干仪：HP–5016型，上海洛成分析仪器有限公司;漩涡混匀器：IKAMS3basic型，德国IKA公司;离心机：TDZ5–WS型，长沙湘智离心机仪器有限公司;超生波清洗机：SB–800DT型，宁波新芝生物科技有限公司;超纯水系统：Milli-Q型，美国Millipore公司;多功能净化柱(MFC)：Mycosep228AflaPat，美国RomerLabs公司;甲醇、乙腈：色谱纯;黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2标准品：2.0μg/mL，美国Sigma公司;实验用水为Millpore超纯水系统制得。
1.2仪器分析条件
色谱柱：KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm);流动相：甲醇–乙腈–水(体积比为25∶20∶55)，流速为1.0mL/min;进样体积：20μL;柱温：30℃;荧光检测器：激发波长355nm，发射波长430nm。
1.3样品预处理
准确称取5g(精确到0.01g)试样至50mL具塞离心管中，加入25mL乙腈–水混合溶液(体积比为80∶20)，漩涡混匀后超声提取30min，以4000r/min离心10min，吸取10mL上清液至多功能净化柱的玻璃试管中，将装有填料的多功能净化柱插入玻璃试管，并缓慢推动多功能净化柱至玻璃试管的底部，上清液通过多功能净化柱中的填料并与填料充分接触，移取1mL通过多功能净化柱的净化液于另一玻璃试管中，60℃加热,氮气吹干，再加入1mL流动相溶解混匀，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。
2结果与讨论
2.1净化方法
多功能净化柱(MFC)是一种特殊的固相萃取柱，其填料中含有亲脂性(非*性)和电荷活性(*性)成分，可选择性吸附样品提取液中的脂类、蛋白质类化合物和碳水化合物等干扰物质，而让待测化合物通过净化柱，从而达到分离纯化的目的[7]。多功能净化柱操作简便，不需要进行活化、淋洗和洗脱等操作，缩短了样品的前处理时间。笔者选用美国RomerLabs公司的Mycosep228AflaPat多功能净化柱，对牛奶样品中的黄曲霉毒素进行分离纯化，取得了十分理想的效果。
2.2提取方法
样品的提取方法主要根据其物理化学性质来确定。黄曲霉毒素易溶于*性溶剂而不溶于非*性溶剂，且在中性溶液中较稳定，一般使用甲醇、乙腈、丙酮、氯仿或几种有机溶剂的混合液对黄曲霉毒素进行提取。黄曲霉毒素虽然难溶于水，但是提取液中少量的水可以润湿基质，增强有机溶剂在样品中的渗透能力，因此采用有机溶剂与水的混合溶液作为提取剂，可以提高样品的提取效率。分别以乙腈–水体积比为20∶80，40∶60，60∶40，80∶20和100∶0为提取剂对牛奶中黄曲霉毒素进行提取，结果表明，以乙腈–水体积比为80∶20时的提取效率*高，回收率在85%以上。
2.3衍生方法
高效液相色谱法已经成为检测黄曲霉毒素的主要测定方法，但是黄曲霉B1和G1的荧光强度较弱，且黄曲霉毒素B1在水溶液中会发生荧光淬灭，因此需要采用衍生的方法增强B1和G1的荧光强度。常用的衍生方法有柱前三氟乙酸衍生[8]、柱后碘衍生[9]等，但衍生过程复杂、检测灵敏度及重现性受人为因素影响较大。本实验利用环状化合物在紫外光照射下能产生荧光这一特性，采用光化学衍生技术，以流动相中的水作为衍生剂，对黄曲霉毒素进行衍生化处理，使流动相中的水与黄曲霉毒素B1作用，生成荧光特性更强、更稳定的化合物，从而解决了黄曲霉毒素B1在水溶液中发生荧光淬灭的问题，而且增加了黄曲霉毒素的荧光强度[10]。
2.4线性范围和检出限
分别称取适量黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2标准品溶于甲醇，配成质量浓度为60ng/mL的标准储备液。吸取适量体积黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的标准储备溶液，用流动相稀释配成相应浓度的混合标准溶液，并按选定的色谱条件进行分析。结果表明，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的质量浓度与其峰面积具有良好的线性关系，其相关系数在0.9994～0.9999之间，相应的线性回归方程见表1。在空白牛奶样品中加入标准品，按上述方法处理样品，根据3倍信噪比(S/N)峰的响应值计算，得到黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的检出限分别为0.50，0.10，0.50，0.10μg/kg。牛奶加标样品的色谱图见图1。
2.5回收试验与精密度试验
在牛奶空白样品中加入3组不同浓度水平的黄曲霉毒素标准溶液，按实验方法进行样品处理和测定，考察实验方法的回收率，并对加标样品重复测定6次，考察实验方法的精密度，结果见表2。结果表明，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的回收率为85.6%～92.0%，测定结果的相对标准偏差(RSD)为1.72%～3.52%。
3结语
建立了一种以高效液相色谱–荧光检测器同时检测牛奶中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的方法。采用Mycosep228AflaPat多功能净化柱对牛奶样品中的黄曲霉毒素进行分离纯化，并用柱后光化学衍生技术增加黄曲霉毒素的荧光强度。该方法具有简便、快速、准确、灵敏度高等优点，为牛奶中黄曲霉毒素的检测提供了实用的技术手段。
