检测及试验方法
样品前处理(下述提取步骤，均须避光进行。)
1.果汁饮料称取2g试样于10mL容量瓶中,加入40μL 50μg /mL内标液(甲氨蝶呤)和100μL1mg/mL BHT溶液，用水定容至刻度后过膜待测。
2.大米、果冻、饼干称取2g试样于10mL容量瓶中，加入40μL50μg/mL内标液和100μL 1mg/mL BHT溶液，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，涡旋混匀1min，超声15min，4000 r /min离心10 min，过膜待测。
3.含乳饮料称取2g试样于10mL容量瓶中，加入40μL50μg/mL内标液和100μL 1mg/mL BHT溶液，用4%三氯乙酸溶液溶解并定容至刻度，涡旋混匀1min，超声15min，4000 r/min离心10min，过膜待测。
4.奶粉称取5g试样于离心管中，加入200μL50μg/mL内标液和500μL1 mg/mL BHT溶液，用25mL45～50℃水溶解并涡旋混匀1 min，超声15 min。待溶液温度降至室温后，用5 mol/L盐酸溶液调节至pH 1.90±0.5，放置2min，再用5mol/L氢氧化钠溶液调节至pH 4.7±0.5。将溶液转移至50mL容量瓶中，用水定容至50mL，超声10min，4000r/min离心10min，过膜待测。
仪器条件
1.色谱条件
Waters HSS T3色谱柱( 50 mm×2. 1 mm，1.7μm) ;进样量5μL;柱温30℃;流动相:A为10 mmol /L乙酸铵( pH 6. 3)水溶液，B为甲醇;梯度洗脱程序: 0～1 min保持B为1%;1～4min，B从1%升至55%; 4～6 min保持B为55%; 6～6.1 min，B降至1%; 6.1～10 min保持B为1%。
2.质谱条件
大气压电喷雾离子源，正离子电离模式。毛细管电压3.5kV;喷雾压力45psi;气帘气流量5L/min;鞘气流量10L/min;鞘气温度350℃;毛细管温度350℃;定性离子对: m/z442.4→176.9，碰撞能量33eV;定量离子对m/z 442.4→295.1，碰撞能量21eV;甲氨蝶呤m/z 445.0→308.0，碰撞能量20eV。
结果与讨论
1.基质及内标物的选择
依据GB14880-2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》，按照可强化食品的不同类别选择并确立6种代表性食品:果汁、奶粉、含乳饮料、大米、饼干和果冻。
通过大量查阅国内外文献，选取D4-烟酸、D4-烟酰胺、乙酰苯胺、马尿酸、甲氨蝶呤及33C5-叶酸放射性同位素内标等6种内标，对其安全性及定量结果的准确性进行比较，*终选择甲氨蝶呤作为内标物。
2.叶酸的稳定性实验
叶酸在酸性溶液中热不稳定，在碱性溶液中易被氧化，水溶液遇光迅速分解，因此需要通过控制溶液所处的环境改善叶酸储备液的稳定性。分别用水、1%氨水、5mgVc、0.01 mol/LHCl(pH 2.0)、0.01mol/L HCl(pH 5.0)、25μLβ-巯基乙醇、1%BHT、10 mmol /L乙酸铵和3%偏磷酸等不同溶剂配制浓度为100μg/mL的标准溶液，并将配制好的溶液用铝箔做避光保护，4℃冰箱中储存。测试不同溶剂不同时间段的峰面积并进行比较，得到叶酸的稳定性曲线图
叶酸的稳定性曲线图
由图可知，叶酸在强酸条件下容易分解，当采用0.01 mol/L HCl(pH 2.0)和3%偏磷酸作为溶剂时，叶酸标准溶液分解现象十分明显;采用水、0.01 mol/LHCl(pH =5.0)和10mmol /L乙酸铵作为溶剂时，溶液在16h内稳定性较好，基本无分解，16～48h出现缓慢分解，48h后分解现象十分明显;当采用1%氨水溶解叶酸时，1～4d内无分解，在第5d分解了10%，因此叶酸标准储备液在1～4d内具有良好的稳定性，能够满足定量分析实验要求。同时，比较了Vc、β-巯基乙醇和BHT 3种抗氧化剂的抗氧化效果，发现添加BHT的溶液在72 h内基本无分解，因此样品前处理过程中加入BHT，能够避免叶酸的氧化，有利于稳定性的提高。
二丁基羟基甲苯( BHT)的优化
由于叶酸的不稳定性，实验过程中需要加入BHT避免叶酸的氧化。用0.01 mol/L HCl溶液配制浓度为100μg/mL的储备液，常温下放置12h后，比较了不同质量分数BHT溶液(0.1%，0.5%，0.8%，1.0%，1.2%，1.5%，2.0%)对叶酸稳定性的影响。对新配制的叶酸储备液进行检测，此时得到的峰面积数据认为无损失，记为****;然后分别取含不同浓度BHT的叶酸溶液进行检测，得到各标准储备液的峰面积，将此峰面积与新配制溶液得到的峰面积进行比较;以BHT含量为横坐标，百分比为纵坐标，得到各标准储备液的稳定性数值如图。结果发现，随着BHT用量的增多，叶酸的分解速度变慢，稳定性提高，但当达到1%时，溶液中的叶酸趋于稳定，因此实验选取加入1%的BHT作为抗氧化剂。
BHT 使用量对反应的影响
