为了对农产品中农药残留进行检测,常规的仪器检测方法往往检测时间较长,且成本较高,并不适用于实际生产经营过程中农产品的快速检测。酶抑制法作为一类快速筛查方法,可以对农药残留进行快速检测,其中*关键的步骤是农药残留对酶的抑制效果的分析,但是游离酶由于稳定性差且在有机溶剂环境下不耐受,而固定化酶可以改善游离酶的缺陷,将酶固定于载体上,同时保留一定的催化活性。本文重点论述了固定化技术、载体及产品在农药残留检测中的应用,为今后农药残留检测固定化酶研究提供一定思路和方法。
吸附法:
吸附法是利用物理方法,将酶固定于载体上,可分为离子吸附、亲和吸附及物理吸附。物理吸附是*常用的,通过氢键、范德华力、疏水相互作用将酶吸附在载体的表面[2]。例如Tallita等[3]将碱性磷酸酶(ALP)以物理吸附的方式固定在聚合物改性电*上制成的电化学传感器可以用于检测4-硝基酚(4-NP)。
包埋法:
包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中。用于包埋的载体一般是壳聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂、海藻酸钙等。该方法可以降低酶的渗出,同时酶与载体之间无化学键连接,保持了酶构象的稳定。然而,底物与酶反应时,会因为包埋结构的特殊性导致底物无法通过保护层而与酶进行反应,这是目前包埋法固定酶的主要缺点之一。同时,仅以物理方法包覆酶可能导致酶的负载效率低[4]。
应用较为广泛的包埋法是溶胶-凝胶法,Du等[5]用正硅酸乙酯和纳米金颗粒(GNPs)制成了用于包埋酶的溶胶-凝胶复合材料,将乙酰胆碱酯酶(AChE)包埋其中制成生物传感器,对有机磷农药进行检测。在抑制率10%时久效磷的检出限为0.6 ng/mL,且具有良好的重现性和稳定性。
但由于溶胶-凝胶法包埋过程中酶容易失活[6],因此一些新的包埋技术也被逐渐研究,江南大学孔军等[7]在研究酶的固定化时发明了一种新的包埋技术,以缺陷型酿酒酵母孢子微胶囊将酶固定化。该方法利用基因工程技术将酶以包埋法形式固定,对比溶胶-凝胶法,可以减少因包埋过程中引入有机溶剂对酶活性造成的损失。
共价结合法:
由于酶的表面存在很多游离基团,如羧基、氨基、巯基等可以与载体表面基团发生化学反应生成共价键,以此原理固定化酶的方法为共价结合法。AChE上含有氨基,因此Khaldi等[8]将单晶硅表面羧基化后,通过酰胺键将AChE共价连接至羧基端。Tallita等[3]同样将电*上的羧基活化后,与碱性磷酸酶(ALP)以形成酰胺键的方式进行固定化,制成的电化学传感器可对有机磷农药进行灵敏检测。
另外还有研究者利用酶表面的羧基进行固定化,Jiang等[9]将胶体金纳米颗粒和重氮树脂固定于对氨基苯磺酸修饰后的玻碳电*表面,形成基质复合膜,用于乙酰胆碱酯酶的固定。类似的基于形成化学共价键的方式固定化可以使酶与载体结合紧密,不易从载体表面脱落。但是由于酶与载体以共价键结合后可能会导致酶的空间构象发生变化,对酶活会造成不同程度的损失。因此以共价结合法固定酶时应该考虑到该缺陷。
交联法:
交联法是利用交联剂与酶蛋白进行交联,通过形成稳定的三维交联网架结构将酶固定。如果交联的是相同的官能团,则被称为同双功能交联剂,例如戊二醛。若交联剂连接的是不同的基团则该种交联剂被称为异双功能试剂[10]。
交联法固定化酶中,戊二醛试剂[11]被广泛使用。毛罕平等[12]使用戊二醛将AChE交联在纸制微流控系统中用于检测对硫磷,检测线性范围在1.0×10-7-1.0×10-5 g/mL内,检出限为3.3×10-8 g/mL。与其它固定化酶方法相比,戊二醛在交联酶时用量较大,当用量大于一定阈值后会使酶失活。Sun等[13]用戊二醛作为交联剂,采用交联法和溶胶-凝胶包埋法两种不同的固定化方法将AChE固定在壳聚糖膜上,结果表明用戊二醛作为交联剂固定化酶的活性明显低于溶胶-凝胶包埋法。所以采用交联法固定化酶时需要优先考虑交联剂的类型是否会对酶造成毒害作用。
氨基酸置换法:
利用对蛋白质进行定点诱变的基因工程技术可以直接改变酶的性质,这种蛋白质性质的变化还可以用于酶的固定化,提高酶的催化性能[14]。即在酶蛋白上合适位点,置换某个氨基酸,突变后的酶蛋白通过该突变氨基酸特殊的侧链基团控制固定酶的方向。Li等[4]通过迭代饱和诱变(ISM)方法筛选得到催化活性*高的甲基对硫磷水解酶(MPH)突变产物,实验证明突变酶可以对甲基对硫磷进行高效地水解,以诱变方法得到突变酶的思路可以借鉴到对农药残留检测当中。但关于这方面的报道还较少,需要进一步研究其实用性。
生物素-亲和素亲和法:
生物素-亲和素亲和法基于生物素与亲和素高效专一性、*强的亲和力可以把酶蛋白与生物素结合成融合蛋白以后,再将融合蛋白固定在亲和素包被的材料中。Zhang等[15]制备了一种基于生物素-链霉亲和素耦联合成方法的免疫传感器用于检测细胞因子IL-6的浓度变化,与共价结合方法相比,该方法可以增加固定在载体表面的抗体数量,使免疫传感器的检测灵敏度达到0.1 pg/mL,检测的线性范围在0.4-400 pg/mL间。