1 范围
本标准规定了进出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌的检验方法。
本标准适用于进出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌的检验。
2 定义
本标准采用下列定义：
厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌
群厌氧、过氧化氢酶阴性、能将亚硫酸盐还原为硫化物的革兰氏阳性梭状芽胞杆菌。是食品、水、食品加工设备、食品生产环境等卫生状况的评估指标菌之一。
3 设备和材料
3.1 均质器
3.2 恒温水浴箱。
3.3 恒温培养箱：36℃±1℃或46℃±1℃。
3.4 厌氧培养装置。
3.5 菌落计数器。
3.6 吸管：1.0mL和10.0mL，分别具有0.1mL和1.0mL刻度。
3.7 培养皿：90mm或100mm。
3.8 低温冰箱
3.9 显微镜。
4 培养基和试剂
4.1 氯化钠胰蛋白胨稀释液：见附录A中A1。
4.2 亚硫酸铁琼脂：见附录A中A2
4.3 庖肉培养基：见附录A中A3。
4.4 3%过氧化氢溶液：使用前配制。
4.5 缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中A4。
5 样品制备
5.1 样品的贮存和运送
冷冻样品如不能立即进行检验，应置于-18C保存；非冷冻而易腐的食品，应加等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体食品应加双料)，置于4C冰箱保存。运送样品时，应采取措施，防止样品中微生物数量和性质发生变化。
5.2 制样
将样品解冻，取25g移入灭菌均质杯，加225mL氯化钠胰蛋白胨稀释液，以800r/min~10000r/min均质2min。如为液体样品，则取样25mL，加人盛有225mL氯化钠胰蛋白胨稀释液的500mL稀释瓶中，摇匀。吸取此1：10样品匀液10mL，加λ90mL.氯化钠胰蛋白胨稀释液中，充分混匀后根据样品污染情况做进一步的系列十倍递增稀释。
若检测厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杄菌的芽胞，可对1：10样品匀液进行75℃ 20min或煮沸保持l0min热处理，之后以流水迅速冷却至室温后再做进一步的系列十倍递增稀释。
6 检验步骤与计数
6.1 平板计数法
适用于检验未经加工处理的生鲜食品及厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌>10/g(mL)的食品。
6.1.1 接种和培养
6.1.1.1 对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸取1mL，一式双份接种于每个灭菌的培养皿中。
6.1.1.2 倾注约15mL制备好的并于水浴箱保温至50℃的亚硫酸铁琼脂。从制备*初稀释液结束到倾注培养基于*后一个平皿所用的时间不应超过15min。仔细将接种物和培养基充分混匀，水平放置使其凝固。
6.1.1.3 待混合物凝固后，再倾注10mL 2%无菌琼脂于已凝固的培养基上作为隔层。
6.1.1.4 待该隔层凝固后反转制备好的平板于36℃±1℃厌氧培养24h~48h。若对培养温度有特殊要求(如46℃)，可根据情况进行培养。
6.1.2 计数
6.1.2.1厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杄菌在亚硫酸铁琼脂上呈黑色菌落。36C±1℃厌氧培养24h后，计数典型的菌落；若平板上无特征性菌落或菌落较小(<0.5mm)，则需继续培养24h再计数；若48h后的菌落增大以至相连，则以24h的计数为准，反之则以48h为准。
那些仅产生氢〔而不是硫化氢(H2S)〕的厌氧菌生长时也可还原亚硫酸盐而导致培养基出现弥散的、非典型的普遍变黑，这种现象不应计数。
6.1.2.2 从可计数的平板(具20~200个菌落)中任取10个典型菌落，分别取培养物按7.1和7.2进行证实试验。对阳性结果进行计数。
6.1.2.3 平板典型菌落数乘以证实为厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌菌落所占比例，再乘以样品稀释倍数即为样品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杄菌的计数，报告为厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌/g(mL)。
6.2 *近似值(MPN)法
适用于检验含有受损伤的厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杄菌的加工食品及厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌≤10/g(mL)的食品。
6.2.1 接种和培养
6.2.1.1 增菌
选用适宜的三个连续稀释的样液，从每个样液中分别吸取1mL，一式三份接种于3管装有庖肉培养基的试管中，36℃±1℃厌氧培养24h~72h。待出现生长特征(培养液混浊、产气、出现异味)后，进行分离培养。反之，则按阴性计数。
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