1 范围
本标准规定了饲料中土霉素、四环素、金霉素的液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于饲料中土霉素、四环素、金霉素的测定。
本标准的方法检出限：50μg/kg。
2 规范性引用文件
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-1992，neq ISO 3696：1987)
3 原理
试样提取液经离心后，上清液用 Oasis HLB 固相萃取柱和阴离子交换柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。
4 试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。
4.1 甲醇：色谱纯
4.2 乙腈：色谱纯。
4.3 盐酸。
4.4 0.4molL盐酸溶液：准确量取32.8mL盐酸于1000mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
4.5 草酸。
4.6 0.01Lmol/L草酸甲醇溶液：准确称取草酸1.26g，用甲醇溶解并定容于1000mn容量瓶中。
4.7 甲酸
4.8 甲酸溶液：准确量取4mL甲酸于1000mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。
4.9 土霉素、四环素、金霉素标准物质：纯度≥95%。
4.10 土霉素、四环素、金霉素标准储备溶液：0.1mgmL。准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、标准物质，分别用甲醇配成0.1mgmL的标准储备液。储备液贮存在-18℃冰柜中。
4.11 土霉素、四环素、金霉素基质混合标准工作溶液：根据需要吸取适量土霉素、四环素、金霉素标准储备溶液，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液，基质混合标准工作溶液在4℃保存，可使用三天。
4.12 OaSis hlB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。
5 仪器
5.1 液相色谱-串联四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源。
5.2 分析天平：感量0.1mg和1mg各一台
5.3 旋涡混匀器。
5.4 固相萃取仪。
5.5 高速离心机
5.6 具塞锥形瓶：50mL。
5.7 离心管：50mL，5mL。
5.8 氮吹仪
5.9 旋转蒸发器。
6 试样的制备
6.1 提取
准确称取3.0g样品(准确至0.01g)，置于50mL具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，旋涡混匀1min，加入盐酸溶液(4.4)30mL，旋涡混匀1min，超声20min，移至50mL离心管中，5000r/mnin离心10min，取上清液，待净化。
6.2 净化
取10mL上清液与40mL水稀释混匀，再移入下接 Oasis hlb柱的贮液器中。溶液以小于1.0mL/min的流速过柱，然后依次用甲醇-水溶液(4.9)淋洗，减压抽干20min。用草酸甲醇溶液(4.6)5mL洗脱，收集洗脱液于40℃减压旋转蒸发至干，用1.0mL流动相溶解残渣，12000r/min离心10min，经0.45μm有机滤膜过滤后，待测。
7 测定步骤
7.1 测定
7.1.1 液相色谱条件
色谱柱：Inertsil C8，3.5μm，150mm×2.1mm(id)或相当者；
流动相：乙腈十甲醇+0.4%甲酸溶液(18+4+78)；
流速：0.2mL/min；
柱温：25℃；
进样量：20μL。
7.1.2 质谱条件
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
电喷雾电压、碰撞电压等条件优化至*佳值；
定性离子对、定量离子对见表1。
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