1 范围
本标准规定了养殖水体中孔雀石绿残留量的测定-液相色谱串联质谱法的原理、试剂、仪器设备、测定步骤、结果计算、检出限、回收率和精密度。
本标准适用于渔业生产养殖水体中孔雀石绿残留量的测定。本方法的检出限为0.05ug/L。
2 规范性引用文件
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 原理
样品中的孔雀石绿用乙腈和二氯甲烷液液萃取，反相色谱柱分离，质谱检测器检测，内标法定量。
4 试剂
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 二氯甲烷。
4.3 无水乙酸铵。
4.4 甲酸。
4.5 甲酸溶液[1+1000]：准确吸取1.00mL甲酸溶于1000mL水中，经0.22μm混合纤维素滤膜过滤。
4.6 乙酸铵缓冲溶液[5mol/L]：称取0.385g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。
4.7 乙腈-乙酸铵混合溶液(1+1)：500mL乙腈与500mL乙酸铵溶液(4.6)超声混合5min。
4.8 盐酸羟胺。
4.9 盐酸羟胺溶液[0.25g/mL]：称取25g盐酸羟胺溶于100mL水中。
4.10 对-甲苯磺酸。
4.11 对-甲苯磺酸溶液[1.0mol/L]：称取17.2g对-甲苯磺酸，用水溶解，并定容至100mL。
4.12 标准品：孔雀石绿(MG)、氘代孔雀石绿(D5-MG)，纯度≥98%。
4.13 标准储备溶液。
4.13.1 孔雀石绿标准储备溶液[1.0mg/mL]：准确称取10.0mg的孔雀石绿标准品，用乙腈配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，-18℃避光保存，保存期3个月。
4.13.2 氘代孔雀石绿标准储备溶液[1.Omg/mL]：准确称取10.00mg的氘代孔雀石绿标准品，用乙腈配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，-18℃避光保存，保存期3个月。
4.14 孔雀石绿标准工作溶液[l00ng/mL、10.0ng/mL]：准确吸取孔雀石绿标准储备溶液(4.13.1)，用乙腈逐级稀释配成100ng/mL和10.0ng/mL的工作溶液，-18℃避光保存，保存期7天。
4.15 氘代孔雀石绿标准工作溶液[l00ng/mL]：准确吸取氘代孔雀石绿标准储备溶液(4.13.2)，用乙腈逐级稀释配成100ng/mL的工作溶液，-18℃避光保存，保存期7天。
注：除非另作说明，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T 6682 一级水指标。
5 仪器和设备
5.1 高效液相色谱-串联质谱联用仪。
5.2 电子天平：感量0.01mg。
5.3 旋转蒸发仪。
5.4 旋涡振荡器。
5.5 超声波振荡器。
6 测定步骤
6.1 样品处理
6.1.1 吸取水样50.00mL，置于250mL分液漏斗中。向分液漏斗中加入20.0μL氘代孔雀石绿标准工作溶液(4.15)、1.5mL盐酸羟胺溶液(4.9)、2.5mL对-甲苯磺酸溶液(4.11)，振摇混匀。
6.1.2 加入10.0mL乙腈、25.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，将下层溶液转移至125mL鸡心瓶中。
6.1.3 继续向分液漏斗中加入10.0mL乙腈、25.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，合并下层溶液于上述125mL鸡心瓶中，于45℃±2℃水浴中减压浓缩至近干。
6.1.4 向鸡心瓶中加入1.00mL乙腈-乙酸铵混合溶液(4.7)，涡旋振荡lmin、超声振荡lmin，样液经0.22μm针孔式有机相滤膜过滤后供高效液相色谱-串联质谱联用仪测定。
6.2 空白试验
准确量取50.00mL不含孔雀石绿的水样，按样品处理步骤进行。
6.3.1 色谱条件
6.3.1.1 色谱柱：C柱，100mm×3.0mm(内径)，粒度1.8μm。
6.3.1.2 流动相：乙腈十甲酸水溶液(0.1%)=60+40(V/V)。
6.3.1.3 流速：0.25mL/min。
6.3.1.4 柱温：35℃。
6.3.1.5 进样量：10μL。
6.3.2 质谱条件
6.3.2.1 离子源：电喷雾ESI源，正离子模式。
6.3.2.2 扫描方式：多反应监测MRM。
6.3.2.3 雾化气压力：40psi。
6.3.2.4 雾化气温度：350℃。
6.3.2.5 雾化气、干燥气为高纯氮气，气体流量：10L/min。
6.3.2.6 碰撞气为高纯氮气，气体压力：0.15MPa。
6.3.2.7 监测离子对：孔雀石绿m/z 329/313、329/208；氘代孔雀石绿m/z 334/318。
6.4 标准曲线的配制
检测前，吸取孔雀石绿标准工作溶液(4.14)、氘代孔雀石绿标准工作溶液[4.15]适量，用流动相配制成浓度分别为0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL、5.00ng/mL的混合标准系列工作溶液，每亳升该溶液含有氘代孔雀石绿2.0ng。将此混合标准系列工作溶液按6.3的仪器条件测定，孔雀石绿以氘代孔雀石绿为内标物，通过仪器工作站制定内标法标准曲线。
6.5 定性依据
在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在士5%以内，且检测到的离子的相对丰度，用与*强离子(基峰)的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度一致。
6.6 定量测定
将样品制备液按6.3测定，通过仪器工作站计算制备液中孔雀石绿的浓度。在上述条件下，标准溶液中孔雀石绿、氘代孔雀石绿的参考保留时间分别为2.203min、2.184min，标准溶液的色谱图及质谱图参见附录A。
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