食品产气荚膜梭菌怎么检测?目前对于食品产气荚膜梭菌有对应的检测方法标准依据。今天百检网就给大家介绍一下食品产气荚膜梭菌的测定方法相关信息。
检测方法标准依据：GB 4789.13-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验
1.范围
本标准规定了食品中产气荚膜梭菌( Clostridium perfringens)的检验方法。
本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。
2.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 恒温培养箱:36℃±1℃;
b) 冰箱:2℃～5℃;
c) 恒温水浴箱:50℃±1℃,46℃±0.5℃;
d) 天平:感量0.1g;
e) 均质器;
f) 显微镜:10×～100×;
g) 无菌吸管:1mL(具0.0lmL刻度)、10mL(具0.lmL刻度)或微量移液器及吸头;
h) 无菌试管:18mmx180mm;
i) 无菌培养皿:直径90mm;
j) pH计或pH比色管或精密pH试纸;
k) 厌氧培养装置。
3.培养基和试剂
3.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂:见附录A中A.1。
3.2 液体硫乙醇酸盐培养基(FTG):见附录A中A.2。
3.3 缓冲动力-硝酸盐培养基:见附录A中A.3。
3.4 乳糖-明胶培养基:见附录A中A4。
3.5 含铁牛乳培养基:见附录A中A5。
3.6 0.1%蛋白胨水:见附录A中A.6。
3.7 革兰氏染色液:见附录A中A.7。
3.8 硝酸盐还原试剂:见附录A中A8。
3.9 缓冲甘油-氯化钠溶液:见附录A中A.9。
4.检验程序
产气荚膜梭菌检验程序见图1。
5.操作步骤
5.1 样品制备
5.1.1 样品采集后应尽快检验,若不能及时检验,可在2℃～5℃保存;如8h内不能进行检验,应以无菌操作称取25g(mL)样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体样品应加双料),并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。
5.1.2 以无菌操作称取25g(mL)样品放入含有225mL0.1%蛋白胨水(如为51.1中冷冻保存样品,室温解冻后,加入200mL0.1%蛋白胨水)的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1min～2min;或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中,8000r/min～10000rmin均质1min～2min,作为1:10稀释液。
5.1.3 以上述1:10稀释液按1mL加0.1%蛋白胨水9mL制备10-2～10-6的系列稀释液。
5.2 培养
5.2.1 吸取各稀释液1mL加入无菌平皿内,每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温)15mL,缓慢旋转平皿,使稀释液和琼脂充分混匀。
5.2.2 上述琼脂平板凝固后,再加10mL冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温)均匀覆盖平板表层。
5.2.3 待琼脂凝固后,正置于厌氧培养装置内,36℃±1℃培养20h～24h。
5.2.4 典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。
5.3 确证试验
5.3.1 从单个平板上任选5个(小于5个全选)黑色菌落,分别接种到FTG培养基,36℃±1℃培养18h～24h
5.3.2 用上述培养液涂片,革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌,有时可见芽孢体。如果培养液不纯,应划线接种TSC琼脂平板进行分纯,36℃±1℃厌氧培养20h～24h挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基,36℃±1℃培养18h～24h,用于后续的确证试验。
5.3.3 取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基,在46℃±0.5℃水浴中培养2h后,每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象,该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质,通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖,凝固酪蛋白并大量产气,呈“暴烈发酵”现象,但培养基不变黑。
5.3.4 用接种环(针)取FrG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基,于36℃±1℃培养24h。在透射光下检査细菌沿穿刺线的生长情况,判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长,无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙以检査亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者,表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐;如果不岀现颜色变化,则加少许锌粉,放置10min,出现红色者,表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
5.3.5 用接种环(针)取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基,于36℃±1℃培养24h,观察结果如发现产气和培养基由红变黄,表眀乳糖被发酵并产酸。将试管于5℃左右放置1h,检査明胶液化情况。
如果培养基是固态,于36℃±1℃再培养24h,重复检査明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖,使明胶液化。
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