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1 范围
本标准规定了灵芝及其制品中灵芝酸A和灵芝酸B的高效液相色谱测定方法。
本标准适用于灵芝及其制品灵芝酸A和灵芝酸B的测定。
本标准灵芝酸A和灵芝酸B的定量测定范围均为30mg/kg~500mg/kg。
本标准灵芝酸A和灵芝酸B的检测限均为10mg/kg。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其*新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 原理
试样中灵芝酸A和灵芝酸B用甲醇超声提取，提取液经氮气吹干后甲醇溶解，高效液相色谱法测定，以保留时间进行定性，外标法定量。
4 试剂
除非另有规定，仅使用色谱纯试剂和符合GB/T 6682 中规定的一级水。
4.1 甲醇(CH3OH)。
4.2 甲酸(CH2O2)。
4.3 乙腈(CH3CN)。
4.4 0.1%甲酸水溶液：取1m甲酸(4.2)定容至1L。
4.5 灵芝酸A(CAS号81907-62-2)和灵芝酸B(CAS号81907-61-1)：纯度≥96%。
4.6 标准溶液：准确称取灵芝酸A(4.5)和灵芝酸B(4.5)标准品各10mg(精确至0.1mg)，用甲醇定容至10mL。该混合标准液中灵芝酸A和灵芝酸B的质量浓度均为1000μg/m，-18℃冰箱保存，有效期3个月。
5 仪器和设备
5.1 高效液相色谱仪，配紫外检测器或二*管阵列检测器。
5.2 超声波清洗器，功率大于450W，频率50Hz~100Hz。
5.3 分析天平，感量0.01g和感量0.0001g。
5.4 有机系滤膜，0.45μm。
5.5 样品粉碎机。
5.6 氮气吹干仪。
6 分析步骤
6.1 试样制备
取不少于200g具代表性灵芝子实体，用样品粉碎机(5.5)粉碎(超细粉等无需粉碎)，将样品装于密封容器中，制成待测样，0℃~20℃保存备用。
6.2 试样提取
称取粉碎均匀的试样0.5g(精确至0.001g)于50mL离心管中，加甲醇(4.1)25mL摇匀，置于超声波清洗器(5.2)中超声提取30min，提取液经滤纸过滤，取滤液5mL置于10mL刻度试管中，于50℃左右氮气吹干，残留物用1.0mL甲醇(4.1)溶解，过滤膜(5.4)，供高效液相色谱仪分析。
6.3 测定
6.3.1 色谱参考条件
色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm，或相当规格色谱柱。
流动相：乙腈(4.3)+0.1%甲酸水溶液(4.4)=30+70
流速：1.0mL/min。
柱温：40℃。
波长：258nm。
进样量：20μL。
6.3.2 标准曲线
准确吸取适量混合标准溶液(4.6)用甲醇稀释，配制质量浓度为1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/m、20.0μg/mL和50.0μg/mL的标准工作液，按参考色谱条件测定，以灵芝酸A和灵芝酸B的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算线性回归方程。标准品色谱图参见图A.1。
6.3.3 测定
按照保留时间进行定性，样品与标准品保留时间的相对偏差不大于2%，单点或多点校正外标法定量。待测样液中灵芝酸A和灵芝酸B的响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。同时做空白试验。
7 结果计算
试样中灵芝酸A和灵芝酸B的量以质量分数a计，单位以毫克每千克(mg/kg)表示，按式(1)计算。
w=A*p*V/（As*m）*f
式中：
A——试样中灵芝酸A或灵芝酸B的峰面积；
As——标准工作液中灵芝酸A或灵芝酸B的峰面积；
p——标准工作液中灵芝酸A或灵芝酸B的质量浓度，单位为微克每毫升(pg/mL)；
V——试样液*终定容体积，单位为毫升(mL)；
m——试样的质量，单位为克(g)；
f——样品稀释倍数。
以两次平行测定值得算数平均值作为测定结果，计算结果保留三位有效数字。
8 精密度
8.1 重复性
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的**差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。
NY/T 2278-2012 灵芝产品中灵芝酸含量的测定 高效液相色谱法
