慢病毒( lentivirus) 载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒( human immunodeficiency virus，HIV-1) 为基础发展起来的基因治疗载体，区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒源于逆转录病毒，但又有所不同，在感染能力方面比逆转录病毒还强，又很少引发免疫反应。在基因治疗中慢病毒载体具有容纳外源性目的基因片段大、稳定整合、持久表达、免疫反应小等优点。慢病毒载体的研究发展得很快，研究也非常深入，在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，取得了明确的临床疗效，显示出广阔的应用前景。
近年来，由学术研究者和研发公司采用慢病毒载体成功对 T 细胞进行遗传操作的试验，用于癌症适应证过继治疗成为研究热点。FDA 于 2017 年分别批准了诺华公司的 CAR-T 产品 Kymriah 和 Kite Pharma 公司的 Yescarta，此外，几个研究中心正在尝试使用慢病毒载体技术进行基因转移改造的造血干细胞和其他靶标。因此，考虑到慢病毒载体技术的广泛应用，具有复制能力的慢病毒检测逐渐成为重要问题。
由于目前载体系统相关的复制型慢病毒(RCL)结构复杂性导致 RCL 检测分析存在挑战性，前期载体系统中 RCL 产生的主要原因是转移载体和包装载体同源序列的重组。随着新的载体系统的发展与应用，载体系统中各元件之间发生同源重组的变化导致 RCL 生成机制和结构的变化愈加复杂。而且，重组不仅限于载体系统之间各组分发生的重组，也包括载体成分和细胞基因组之间的重组。因此，为确保慢病毒载体相关产品在临床应用中的安全性，需要考虑将 RCL 作为一项关键的控制项目。笔者针对目前文献报道对相关检测方法进行简单阐述，主要阐述内容包括检测方法的原理、利弊分析及前景与展望方面。
**，这种方法的灵敏性较高。基于文献报道，采用人为制造的RCL 进行检测( 该 RCL 可编码 Gag，Pol，Tat，Rev 基因以及 Env 和 VSV-G 包膜基因，另外在 Nef 结构区域插入 IRES-eYFP 基因) 。这种人造的 RCL 可赋予病毒独特的性质( 包含 VSVG 或双嗜性 Env 顺式配置) 。结果表明: 采用这种人为制造的 RCL 转染293T 细胞进行灵敏度验证，可达到 100 IU·mL-1。其次，该方法不同于 p24 ELISA 和 Q-PCR 方法( 仅是依赖 HIV 的基因产物而不是实际的 RCL) ，其检测过程是基于 RCL 可以激发含有整合性复制缺陷病毒表达抗性基因。
但不可否认的是，虽然这种人为制造的 RCL 包含有效病毒复制所必需的顺式和反式作用元件，而这种结构可能不是在 293T 细胞生产慢病毒过程中恢复突变产生的典型 RCL，因此无法证实该方法在基因治疗产品中检测 RCL 的准确性和特异性。另外现有文献资料尚不清楚来自载体生产过程中回复突变形成的 RCL 是否会激活标志物。*后这种测定方法和细胞共培养法的时间周期一样，整个测试周期需要 3 ～ 6 周。
载体和病毒颗粒之间的相似性增加了 RCL 检测的复杂性，RCL 的许多组分与载体颗粒( 衣壳、整合酶和逆转录酶) 的组分相似，因此大多数蛋白检测方法都存在误差。如前文所描述的几种检测方法，基于快速放行的 PCR /QPCR 方法会因为细胞或质粒 DNA 携带到载体产物中导致假阳性率的发生;合胞体形成测定法仅适合具有全能力的、包含 Env元件慢病毒，且该方法的灵敏度尚未得到广泛研究验证; 标志物补救测定法尚不清楚来自载体生产过程中的 RCL 是否会激活标志物; 逆转录酶活性测定法( PERT) 不能区分 RCL 和载体颗粒，且细胞中固有的内源性病毒颗粒也会影响检测结果的判断。迄今为止，所有非培养测定法都缺乏基于培养的测定法的敏感性，根据 FDA 2006 年发布的关于 ＲCＲ 检测的指南和 2018 年*新更新的检测指南征求意见稿，目前 RCR /RCL 检测的金标准是共培养法，即将测试样品( 病毒载体上清液、生产终末细胞、体外转导细胞等) 与允许细胞系进行共培养，至少 5 次传代以扩增任何潜在的 RCR /RCL，然后通过指示细胞法或检测特异性核酸/蛋白的方法进行测定。
我国自 2017 年 12 月颁布《细胞治疗用产品的研究与评价技术指导原则》(试行版) 以来，国家药品监督管理局药品审评中心陆续与申请人针对多个品种召开沟通交流会，也邀请了工业界、研究机构相关专家就 IND 阶段细胞治疗产品药学研究及申报资料考虑要点展开讨论，并达成相关共识，*大程度提高了 CAR-T 产品研发和申报资料的质量。经粗略统计，目前进入中心待审评以及审评完成的品种数量已超过 10 余家，且部分申报企业已获得临床批件。
回顾目前的审评资料，各家针对 RCL 检测方法存在较大差异，笔者分析原因: 一方面由于对 RCL风险重视程度不足，第二方面大多数参照 FDA 已批准产品的放行检测方法进行照搬( Q-PCR 法) ，而未对该产品在过程中如何控制进行深入研究，第三是由于国内还未有相关检测机构，且未建立成熟的检测方法。笔者认为，虽然目前临床使用的载体系统已经改进，且基于国内外研究报道还未发现存在RCL 的风险，但我们目前对形成RCL 的重组机制的认知有限，同时细胞产品生产过程中 RCL 的控制是影响产品质量和临床用药安全性的关键因素。建议申请人可参考 FDA *新颁布的《关于 RCR /RCL 检测征求意见稿》适用的内容，在细胞产品生产过程中加强对 RCL 的检测及控制，并建议在慢病毒载体上清液和生产终末细胞采用基于细胞培养方法进行检测，对于新鲜输注细胞或其他时间限制的转导细胞，在积累了足够的基于细胞培养方法无 RCR /RCL风险的足够数据时，可采用 PCR 方法作为快速放行方法，但对于替代方法应提供充分的方法灵敏度、特异性和重复性验证数据。
未来随着科学的进步和对 RCL 认知的加深，以及新技术和新方法的应用，我们希望能与业界专家共同探讨，一切从患者安全性角度考虑，在减轻申请人大量检测投入的基础上寻求更加安全、便捷和准确的检测方法。
参考来源：崔靖,韦薇,罗建辉.复制能力慢病毒检测方法的研究进展[J].中国新药杂志,2019,28(22):2718-2723.
