1.范围
本标准规定了婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定。
2.规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
3.原理
利用干酪乳杆菌( Lactobacillus casei)ATCC 7469对叶酸的特异性,在含有叶酸的样品中生长产生的酸度和形成的光密度来测定叶酸的含量。
4.试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水。
4.1 鸡胰腺:称取100mg干燥的鸡胰腺,加20mL蒸馏水,搅拌15min,离心10min(3000转分钟),取上清液,临用前配制。
4.2 0.9%生理盐水:称取9.0g氯化钠溶解于100mn水中,分装于具塞试管中,每管10mL,121℃灭菌15min。每周准备一次。
4.3 磷酸盐缓冲液
4.3.1 磷酸盐缓冲液Ⅰ(0.05mol/L):称取5.85g磷酸二氢钾,1.22g磷酸氢二钾,用1000mnL水溶解。临用前按0.5g/100mL加入抗坏血酸。
4.3.2 磷酸盐缓冲液Ⅱ(用于谷物及谷物制品前处理):称取14.2g磷酸氢二钠,用1000mL水溶解。临用前按1.0g/100mL加入抗坏血酸,用氢氧化钠溶液A(4.16)调pH至7.8±0.1。
4.3.3 磷酸盐缓冲液Ⅲ(用于谷物及谷物制品测试):称取14.2g磷酸氢二钠,用1000mnL水溶解。临用前按1.0g/100mL加入抗坏血酸,用氢氧化钠溶液A(4.16)调pH至6.8±0.1。
4.3.4 磷酸盐缓冲液Ⅳ(0.1 mol/L)(用于谷物及谷物制品标准溶液制备):溶解13.61g磷酸二氢钾于水中稀释到1000mL。用氢氧化钾溶液(4.10)调pH至7.0±0.1。
4.4 叶酸标准品。
4.5 氨水(10.8%)
4.6 甲苯(C7H8)。
4.7 抗坏血酸(C6H8O6)。
4.8 菌株:干酪乳杆菌( Lactobacillus casei)ATCC 7469。
4.9 培养基
4.9.1 乳酸杆菌琼脂培养基:胨化乳15g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,番茄汁100mL,磷酸二氢钾2g,聚山梨糖单油酸酯1g,琼脂10g,加蒸馏水至1000mL,调pH至68±0.2(20℃～25℃)。121℃高压灭菌15min,备用。
4.9.2 乳酸杆菌肉汤培养基:胨化乳15g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,番茄汁100mL,磷酸二氢钾2g,聚山梨糖单油酸酯1g,加蒸馏水至1000mnL,调pH至68±02(20℃～25℃)。121℃高压灭菌15min,备用。
4.9.3 叶酸测定用培养基:酪蛋白胨10g,葡萄糖40g,乙酸钠40g,磷酸氢二钾1g,磷酸二氢钾1g,DL-色氨酸0.2g,L-天门冬氨酸0.6g,L-半胱氨酸盐酸盐0.5g,硫酸腺嘌呤10mg,盐酸鸟嘌呤10mg,尿嘧啶10mg,黄嘌呤20mg,聚山梨糖0.1g,谷光甘肽5mg,硫酸镁0.4g,氯化钠20mg,硫酸亚铁20mg,硫酸锰15mg,核黄1mg,p-氨基苯甲酸2mg,维生素B6 4mg,盐酸硫胺素400μg,泛酸钙800μg,烟酸800μg,生物素20μg,加蒸馏水至1000mnL,调pH至6.7±0.1(20℃～25℃)。
注:市售商业化合成培养基效果更稳定。
4.10 氢氧化钾溶液(4mol/L):称取224g氢氧化钾于1000mL烧杯中,用400mL水溶解,冷却至室温后,转移至1000mnL容量瓶中,用水定容。
4.11 木瓜蛋白酶溶液:1g蛋白酶(活力≥6000U/mg,pH6.0±0.1,40℃)溶于100mL磷酸盐缓冲液Ⅰ(4.3.1)中。临用前配制。
4.12 α-淀粉酶溶液:1gα-淀粉酶(1.5U/mg)溶于l00mL磷酸盐缓冲液Ⅰ(4.3.1)中。临用前配制。
4.13 0.22μm灭菌滤膜。
4.14 标准溶液的制备
4.14.1 叶酸标准贮备液(500μg/mL):称取55mg～56mg(精确至0.lmg)叶酸标准品(4.4),用50mL蒸馏水转入100mL容量瓶中,加2mL氨水(4.5)。溶液制备后,按式(1)计算溶液的体积,要求贮备液中叶酸盐的浓度为500μg/mL:
用水稀释溶液至刻度,用吸管加水至计算要求的体积,充分混合,放入棕色试剂瓶中2℃～4℃冰箱冷藏,保存期为4个月。
4.14.2 叶酸标准中间液(50μg/mL):吸取10mL叶酸标准贮备液(4.14.1)于100mL棕色容量瓶中,用水定容至刻度,充分混匀,2℃～4℃冰箱冷藏,保存期为1个月。
4.14.3 叶酸标准工作液(0.05ng/mL,0.1ng/mL):吸取1mL叶酸标准中间液(4.14.2)于100mL棕色容量瓶中,用水定容至刻度,混合。再吸该液1mL于100mL棕色容量瓶中,定容,混合。从上液中分别吸取5mL于250mL和500mL棕色容量瓶中,用磷酸盐缓冲液Ⅰ(4.3.1)定容到刻度,混匀,即为高浓度标准工作液(0.1ng/mL)和低浓度标准工作液(0.05ng/mL)。临用前配制。
4.15 盐酸(1mol/L):量取83.0mL盐酸溶于水中,冷却后定容至1000mnL。
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