1 范围
本标准规定了测定饲料中氯氮革、硝西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、劳拉西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑和地西泮等9种苯骈二氮杂革类药物含量的液相色谱串联质谱法(LCMS/MS)。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。
LC-MS/MS法定量限为0.03mg/kg。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件，其*新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料采样
GB/T 20195 动物饲料试样的制备
3 原理
在碱性条件下，用乙酸乙酯提取饲料中苯骈二氮杂革类药物，蒸干提取液用正已烷溶解残渣，经过硅酸镁固相萃取小柱富集、净化，LC-MS/MS分离测定。
4 试剂和材料
除非另有规定，仅使用确认为分析纯的试剂。
4.1 水，GB/T 6682，一级和三级。
4.2 甲醇：色谱纯。
4.3 乙腈：色谱纯。
4.4 甲酸：优级纯。
4.5 正己烷。
4.6 氯化钠。
4.7 乙酸乙酯。
4.8 碳酸钠饱和溶液：称取56g碳酸钠，加入100mL水(三级，4.1)，搅拌、配制成饱和溶液。
4.9 0.05%甲酸溶液：准确移取5.00mL甲酸(4.4)于100mL容量瓶中，用水(一级)定容，用0.20μm膜过滤后，再准确移取10.00mL于1000mnL容量瓶中，用水(一级)定容、摇匀。用前超声5min。
4.10 洗脱液I：甲醇(4.2)+正已烷(4.5)+丙酮=45+45+10。
4.11 洗脱液Ⅱ：甲醇十水(一级)=70+30。
4.12 苯骈二氮杂革类药物混合贮备溶液(100μg/mL)：分别准确称取9种苯骈二氮杂革类药物(氯氮革、硝西泮、奧沙西泮、氯硝西泮、劳拉西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑和地西泮)化学对照品(各种药物的纯度以****计)100mg(精确到0.1mg)于100nL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，配制成浓度各为
100μg/mL 的苯骈二氮杂革类药物混合贮备溶液。置于4℃~8℃冰箱中保存，有效期为1个月。
4.13 苯骈二氮杂革类药物中间溶液(1.00μg/mL)：准确移取苯骈二氮杂革类药物混合贮备溶液(4.12)l00mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容。置于4℃~8℃冰箱中保存，有效期为1周。
4.14 苯骈二氮杂革类药物工作溶液：分别准确移取苯骈二氮杂革类药物中间溶液(4.13)50μL、100μL、200μL、300μL、500μL、750μL，用洗脱液Ⅱ(4.11)稀释至lmL配制成工作溶液，浓度分别为0.05ug/ml、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.50μg/mL、0.75μg/mL。现用现配。
4.15 硅酸镁固相萃取小柱：500mg/6mL。
5 仪器
5.1 实验室用样品粉碎机。
5.2 分析天平：感量0.1mg。
5.3 带盖塑料离心管：100mL。
5.4 漩涡混合器。
5.5 离心机。
5.6 旋转蒸发仪：配备150mL鸡心瓶。
5.7 氮吹仪。
5.8 固相萃取装置。
5.9 超声波清洗器。
5.10 液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源。
6 采样
6.1 采样步骤：按GB/T 14699.1 的规定执行。
6.2 试样的制备：按GB/T 20195 的规定制备试样，全部通过0.45mm孔径的筛，混匀，装入密闭容器中避光保存备用。
7 分析步骤
7.1 提取
称取约5g试样(精确到0.1mg)于离心管(5.3)中，加入2g氯化钠(4.6)，加入20mL三级水，用碳酸钠饱和溶液(4.8)调pH至9~10。加人30ml。乙酸乙酯(4.7)，加盖密封，漩涡(5.4)混匀1min，置离心机(5.6)4 360g离心5min，吸取上消液于150mL鸡心瓶(5.6)中。再加入30mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并2次提取液。
7.2 净化
将提取液在60℃的旋转蒸发仪上蒸至近干，用5nL正己烷溶解残渣，加载到已用5mL正乙烷活化的硅酸镁固相萃取小柱(4.15)，液体的过柱速度不要超过lmL/min；用3mL正己烷清洗鸡心瓶，清洗液也加载到硅酸镁固相萃取小柱中；用5mL洗脱液Ⅰ(4.10)洗脱，收集洗脱液于10mL具塞试管中，在40℃水浴中用氮气(5.7)吹干；再准确移取3.00mL洗脱液∏洗脱，加压吹干硅酸镁固相萃取小柱，收集洗脱液于同一具塞试管中，溶解残渣，漩涡混匀，过0.20μm有机滤膜，上机测定。如果上机溶液中各药物的浓度不在工作溶液范围内，用洗脱液Ⅱ进行调整。
7.3 测定
7.3.1 液相色谱测定参数的设定
色谱柱：C18柱，柱长100mm，内径3.0mm，粒度1.8μm或性能类似的分析柱。
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