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食品中海洋生物毒素之检验方法－神经性贝类毒素之检验（草案
Method of Test for Marine Biotoxins in FoodsTest of Neurotoxic Shellfish Poison
1. 适用范围：本检验方法适用于贝类中神经性贝类毒素（neurotoxicshellfish poison, NSP之检验。
2. 检验方法：检体经萃取后，以小鼠生物试验（mouse bioassay之方法。
2.1. 装置：
2.1.1. 均质机（Homogenizer。
2.1.2. 减压浓缩机（Rotary evaporator。
2.1.3. 振荡器（Shaker。
2.1.4. 离心机：可达6000 × g以上。
2.2. 试药：盐酸、无水乙醚、Tween-60、氯化钠及次氯酸钠均采用试药特级；去离子水（比电阻于25℃可达18 MΩ •cm以上。
2.3. 器具及材料：
2.3.1. 离心瓶： 500 mL，PP材质。
2.3.2. 容量瓶：100 mL及1000 mL。
2.3.3. 分液漏斗：500 mL。
2.3.4. 烧杯：500 mL。
2.3.5. 减压浓缩瓶：500 mL。
2.3.6. 布氏漏斗。
2.3.7. 金属筛网：孔径2 mm。
2.3.8. 刀片或小刀。
2.3.9. 注射针：1 mL，针头25 G以上。
2.3.10. 计时器。
2.4. 试验动物：ICR品系雄性小鼠，体重14～20 g。
2.5. 试剂之调制：
2.5.1. 0.85%氯化钠溶液：称取氯化钠0.85 g，以去离子水溶解使成100 mL。
2.5.2. 1% Tween-60氯化钠溶液：称取Tween-60 1 g，以0.85%氯化钠溶液溶解使成100 mL。
2.5.3. 5%次氯酸钠溶液：称取次氯酸钠50 g，以去离子水溶解使成1000 mL。
2.6. 检体前处理（注1：
2.6.1. 生鲜含壳贝类检体：
用水将检体外壳彻底洗净，以刀片或小刀切断闭壳肌开壳，用水冲洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在绞合部之组织分开，取出贝肉，勿割破肉体。开壳前不可加热或使用麻醉剂。称取贝肉200 g置于金属筛网上，沥水5分钟，去除碎壳等杂物，将贝肉均质后备用。
2.6.2. 冷冻检体：
检体于室温下退冰成半冷冻状态。带壳检体按2.6.1.节清洗、开壳、冲洗取出贝肉及除去贝肉外部附着之冰片，擦干水分后于室温下回温。称取贝肉200 g置于金属筛网上，沥水5分钟，将贝肉均质后备用。
2.6.3. 贝类罐头：
将检体内容物沥干水分，倒入均质机均质后备用。
2.6.4. 贝类干制品：
称取检体100 g，加入足量清水，于4℃冷藏浸泡24～48小时，沥干水分后均质备用。
2.6.5. 腌渍品：
检体先以水洗，去除盐分，沥干水分后均质备用。
注1：每种贝类检体至少要取10个以上，且贝肉需达200 g以上。冷冻检体送验时须为冷冻状态或运送温度应保持0～10℃。
2.7. 检液之调制：
取2.6.节均质后检体100 g，置于烧杯中，加入氯化钠5 g及盐酸1mL，加热搅拌至沸腾，转小火煮5分钟，冷却至室温，移入离心管瓶，以无水乙醚50 mL清洗烧杯，洗液并入离心瓶中，再加入无水乙醚100 mL，盖上盖子充分振荡，以6000 × g离心15分钟。将上层液移至分液漏斗中，残渣再以无水乙醚250 mL分三次重复萃取，将无水乙醚层并入分液漏斗中，轻轻振摇，避免生成乳浊液，静置分层，去除下层水层及贝肉碎片，将上层无水乙醚层移入减压浓缩瓶中，于35℃减压浓缩去除无水乙醚，残留物以1% Tween-60氯化钠溶液清洗至*终体积为10mL，混合均匀，供作检液。
2.8. 小鼠生物试验操作：
取检液各1 mL，分别注入3只小鼠腹腔 （注2，观察是否使试验动物产生特异性临床征状，如呼吸困难、步履蹒跚、翻滚、四肢抽搐等，并以计时器记录致死时间。自注射起连续观察930分钟，若小鼠的中间致死时间（第2只小鼠死亡时间在2小时以内，则用1% Tween-60氯化钠溶液稀释检液后重新注射另外3只小鼠，直到小鼠的中间致死时间在2～6小时内。另取1%Tween-60氯化钠溶液1 mL作空白对照组，同检液组操作。
注2：注射时若有检液溢出，须将该小鼠丢弃，并重新注射一只。
2.9. 检体毒素剂量之计算：
由检液组或稀释液组中各小鼠死亡时间参照致死时间－小鼠单位换算表（附表一，查出对应之小鼠单位，与小鼠体重－小鼠单位校正表（附表二之校正系数相乘，求得各小鼠CMU （i，取各小鼠CMU （i之中位数（CMU （g （注3，并依下列计算式求出检体毒素剂量（MU/kg：
CMU（g：检液组或稀释液组中各小鼠CMU（i的中位数（MU/mL
F：检液稀释倍数
W：检液1 mL相当之检体重量（g/mL
注3：若检液组或稀释液组仅2只小鼠于930分钟内死亡，计算2只小鼠CMU （i，取较小CMU （i为CMU （g，计算检体毒素剂量；若检液组仅1只小鼠于930分钟内死亡，或所有小鼠均不死亡，则检体毒素剂量以< 100 MU/kg表示。
附注：手套、玻璃制品等用过器材，及废弃萃取液应浸泡5%次氯酸
钠溶液1小时以上，使毒素分解，再作清洗或丢弃。
参考文献：
1. American Public Health Association. 1970. Recommended procedures for the examination of sea water and shellfish. 4thEdition. pp. 61-66. APHA. New York, NY, USA.
2. 国家食品药品监督管理总局。 2016。食品安全国家标准贝类中神经性贝类毒素的 测 定。中华人民共和国国家标准。GB5009.261。
附表一、神经性贝类毒素之致死时间－小鼠单位换算表
附表二、小鼠体重－小鼠单位之校正表
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