摘要：本
随着生活水平的提高，人们对健康和卫生的要求越来越高，鞋子内部的高温、潮湿
抗菌是抑制细菌生长、阻止细菌繁殖的一种控制措施，使机体不受微生物活动的危害、防止物品因微生物生长活动而腐败变质或成为传播微生物危害的媒体。针对目前抗菌材料在制鞋行业广泛应用而专门制定了关于鞋类衬里和内垫材料抵抗某种菌类的技术条件的标准，此标准采用了卫生部通用的菌液吸收法和膜接触法。本文主要通过菌液吸收法试验，研究了菌种不同代数对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌抗菌效果检测的影响。
1.试验设备与材料
1.1试验设备
压力蒸汽灭菌器；恒温培养箱；冰箱；超净工作台；电子天平，精确度± 0.01 g；三角烧瓶；试管；移液管；酒精灯；接种环；培养皿。
1.2试剂和培养基
营养肉汤：蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000mL， pH为7.0～7.2；
营养琼脂：蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.2；
平板计数琼脂：胰蛋白胨5.0g、酵母粉2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.2；
洗脱液：含0.85％NaCl的生理盐水，pH为7.0～7.2；
磷酸盐缓冲液（PBS）：磷酸氢二钠 2.83g、磷酸二氢钾 1.36g、蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.2。
1.3检验菌种
大肠杆菌 ATCC 25922、大肠杆菌8099、大肠杆菌CMCC 44825、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、金黄色葡萄球菌CMCC 26003 、金黄色葡萄球菌CMCC 26071、白色念珠菌ATCC 10231。
2.试验方法
2.1菌种活化
将标准菌株接种于营养琼脂斜面上，在（37±1）℃培养24h后，在5℃~10℃下保藏（不得超过一个月），作为斜面保藏菌。将斜面保藏菌转接到平板营养琼脂培养基，在（37±1）℃培养（24±1）h，每天转接1次，不超过2周。试验时应采用2代~8代的24h内转接的新鲜细菌培养物。
2.2菌悬液的制备
用接种环从2.1新鲜培养物上刮1环新鲜细菌，加入培养液中，并依次做10倍梯度稀释至所需要的浓度（约2.5×105cfu/mL~1×106cfu/mL）。
2.3试验步骤
2.3.1 样品接种
将样品分别放于灭菌的培养皿中，然后准确移取（1.0±0.1）mL的菌液均匀接种到样品上。将这些样品在无菌状态下转移到广口瓶中，盖紧瓶盖以防蒸发。
2.3.2 “0”接触时间的对照样、未接种试样的洗脱
接种后尽快向对照样、未接种试样中加入（100±1）mL洗脱液，充分振荡1min，参考GB 4789.2-2010进行活菌计数。
2.3.3 样品接种后的培养、洗脱
将接种后的三组对照样和三组抗菌样在（37±1）℃条件下培养24h。培养结束后，在对照样和抗菌样的瓶中加入（100±1）mL洗脱液，振荡洗脱1min后，参考GB 4789.2-2010进行活菌计数。
2.4结果计算及评定
2.4.1细菌数记录
如经100稀释度培养得到的活菌数为0，则记为＜100.
2.4.2抗菌率计算
抗菌率的计算依据QB/T 2881-2007鞋类衬里和内垫材料抗菌技术条件
R=(A-B) /A×100
R：抗菌率，％；A：经24h培养的三个标准空白样的活菌数的平均值；
B：经24h培养的三个抗菌样品的活菌数的平均值。
3.结果与
3.1菌种不同代数对抗菌效果的影响
分别采用第2、3、4、5代的金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠杆菌ATCC 25922、白色念珠菌ATCC10231进行试验，结果见表1。
表1 菌种不同代数对抗菌效果的影响
菌种 代数 | 金黄色葡萄球菌 | 大肠杆菌 | 白色念珠菌 | ||||||
A | B | R | A | B | R | A | B | R | |
2 | 1.23×105 | 1.71×104 | 86.10 | 1.84×104 | 2.42×103 | 86.85 | 1.85×104 | 4.47×103 | 75.84 |
3 | 2.63×105 | 1.75×104 | 93.35 | 2.37×105 | 1.87×104 | 92.11 | 2.48×105 | 2.08×104 | 91.61 |
4 | 2.36×105 | 1.07×104 | 95.47 | 2.62×105 | 1.85×104 | 92.94 | 2.80×105 | 1.90×104 | 93.21 |
5 | 1.24×105 | 9.56×103 | 92.29 | 1.83×105 | 1.49×104 | 91.86 | 2.37×105 | 2.12×104 | 91.05 |
6 | 2.41×105 | 1.75×104 | 92.74 | 1.73×105 | 1.65×104 | 90.46 | 2.55×105 | 2.44×104 | 90.43 |
7 | 1.78×105 | 1.51×104 | 91.52 | 2.47×105 | 2.34×104 | 90.53 | 1.93×104 | 2.23×103 | 88.45 |
8 | 1.71×105 | 1.57×104 | 90.82 | 1.95×104 | 2.23×103 | 88.56 | 2.60×105 | 2.64×104 | 90.67 |
由表1可以看出，在菌液吸收法抗菌检测中，采用第3、4、5、6代的菌种制作菌悬液进行试验，作用24h后，样品对大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌的抗菌率均在90%以上；采用第2代的菌种制作菌悬液进行试验，作用24h后，样品对大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌的抗菌率均在90%以下，且对白色念珠菌的抗菌率*小；采用第7、8代的菌种制作菌悬液进行试验，作用24h后，样品对金黄色葡萄球菌的抗菌率均在90%以上，样品对大肠杆菌、白色念珠菌的抗菌率低于90%。若试验菌的活性低，同样的试验方法测出的抗菌率往往偏低难于得出正确的数据，特别是接种液不新鲜时表现尤为明显。菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失，并且微生物在传代过程中也易发生变异甚至死亡，因此我们要对菌种进行复壮，且传代次数不能过多，建议采用3～5代的新鲜培养物。
3.2菌种不同来源对抗菌效果的影响
分别采用金黄色葡萄球菌的三个不同来源的第三代菌株：ATCC 6538 、CMCC 26003 、CMCC 26071；大肠杆菌的三个不同来源的第三代菌株：ATCC 25922、8099 、CMCC44825进行试验，结果见表2。
表2 菌种不同来源对抗菌效果的影响
试验 次数 | 金黄色葡萄球菌 | 大肠杆菌 | ||||||
菌种编号 | A | B | R | 菌种编号 | A | B | R | |
1 | ATCC 6538 | 8.97×104 | 7.13×103 | 92.05 | ATCC 25922 | 1.83×105 | 1.48×104 | 91.91 |
CMCC 26003 | 1.35×105 | 1.07×104 | 92.07 | 8099 | 2.40×105 | 2.24×104 | 90.67 | |
CMCC 26071 | 2.57×105 | 1.75×104 | 93.19 | CMCC 44825 | 2.47×105 | 2.34×104 | 90.53 | |
2 | ATCC 6538 | 2.74×105 | 1.78×104 | 93.50 | ATCC 25922 | 1.71×105 | 1.57×104 | 90.82 |
CMCC 26003 | 2.63×105 | 1.75×104 | 93.34 | 8099 | 2.58×105 | 1.72×104 | 93.33 | |
CMCC 26071 | 2.57×105 | 1.75×104 | 93.19 | CMCC 44825 | 1.78×105 | 1.51×104 | 91.52 | |
3 | ATCC 6538 | 2.37×105 | 1.20×104 | 91.56 | ATCC 25922 | 2.41×105 | 2.30×104 | 90.46 |
CMCC 26003 | 2.28×105 | 1.27×104 | 94.42 | 8099 | 1.70×105 | 1.48×104 | 91.29 | |
CMCC 26071 | 1.75×105 | 1.17×104 | 93.31 | CMCC 44825 | 2.40×105 | 2.25×104 | 90.63 | |
由表1可以看出，在菌液吸收法抗菌检测中，样品对金黄色葡萄球菌ATCC 6538 、CMCC 26003 、CMCC 26071抗菌率均大于90%，相对差值小于0.02%；样品对大肠杆菌ATCC 25922、8099 、CMCC44825的抗菌率也均大于90%，相对差值小于0.02%。
5.结论
本试验依据QB/T 2881-2007鞋类衬里和内垫材料抗菌技术条件附录A菌液吸收法，对影响抗菌效果检测的关键因素菌种进行了研究。在标准QB/T 2881-2007中，已经对检测的相关因素做了具体要求，本文仅对菌种的传代次数及不同来源进行比较研究。
菌种是从事抗菌检测研究的基本材料，菌种作为一种特殊的标准品，其使用、保存与管理是微生物检测的一项重要工作，微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到*低限度，以减少自发突变的机率。
在制作菌悬液时，建议采用3～5代的新鲜培养物，若无ATCC菌株，也可以用CMCC菌株来替代进行试验。
参考文献
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作者简介：石笛，女，微生物学硕士，**工程师，质量室主任，主要从事菌种鉴定、抗菌防霉检测等方面的研究。
关键词：鞋类衬里和内垫；抗菌检测；菌种