高效凝胶排阻色谱法测定牛血清白蛋白相对分子质量及其分布-百检网

蛋白质具有许多优良的特性，在国内外不少检测标准中［1–2］被选定为评价超滤膜截留性能的标准物质，因而被生产商广泛用于超滤膜生产过程的质量控制。大部分高纯度蛋白价格比较昂贵，实际检测工作中多使用价格较为低廉的牛血清白蛋白作为标准物质对超滤膜截留性能进行评价。而无论是市售蛋白还是实验室自行分离纯化获得的蛋白，其相对分子质量及其分布均存在一定差异，这会在一定程度上影响超滤膜截留性能的检测结果和评价结论。

测定聚合物的相对分子质量、相对分子质量分布通常采用高效凝胶排阻色谱法进行。标准样品应该选择窄相对分子质量分布的物质，且当2×103Da<Mp<106Da（Mp为峰值相对分子质量）时，聚合物的相对分子质量分布宽度指数D（/MMwn）＜1.10（Mw为重均相对分子质量、Mn为数均相对分子质量）才能用作标准物质［3］。因此利用高效凝胶色谱仪对牛血清白蛋白样品进行相对分子质量、相对分子质量分布进行检测，对于完善超滤膜截留性能的检测方法具有非常重要的意义。

标准和文献［4–5］中多利用色谱柱在一定流动相条件下对于低相对分子质量的多肽和蛋白样品进行相对分子质量及其分布进行研究，而对用于超滤膜性能评价的相对分子质量为104～105Da的蛋白质研究较少。使用不同的色谱柱、在不同的流动相、离子强度、pH值等参数下，对相对分子质量及其分布的检测结果也有一定差异。由于蛋白质溶解于纯水中时溶液的酸碱度接近于中性，而文献中多采用有机相和较低pH值的流动相对样品进行测量［6–8］，这和评价超滤膜截留性能时所采用的接近于中性的溶液环境有很大差异，因此采用接近于中性的流动相作为实验条件更加符合实际情况。

到目前为止，我国已经定值的、适合用于评价超滤膜的蛋白质相对分子质量有证标准物质只有牛血清白蛋白（Mp=66446Da）、马心肌红蛋白（Mp=16951Da）、细胞色素C（Mp=12355Da）。由于所购蛋白质相对分子质量的定值方法与本方法不同，本实验以标准物质证书给出的参考值作为Mp使用。其它相对分子质量为104～105Da的蛋白质尚未得到准确定值，本实验以供应商提供的数据和文献值作为Mp，建立一种可以快速检测10～67kDa的蛋白相对分子质量和相对分子质量分布的检测方法，并将该方法用于牛血清白蛋白的相对分子质量和相对分子质量分布的测定。

1实验部分

1．1主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent1260Infinity型，美国安捷伦公司；移液器：100～1000μL，德国Eppendorf公司；电子天平：CP225D型，德国Sartorius公司；pH计：ORION3STAR型，美国Thermo公司；超纯水机：UPH–I–40型，成都超纯科技有限公司；样品管：5mL；过滤头：0.45μm孔径醋酸纤维素膜；医用注射器：2mL；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：均为色谱纯，美国Sigma公司；氯化钠：色谱纯，天津市光复精细化工研究所；高效凝胶排阻色谱柱：TSKgelG3000SWXL型（300mm×7.8mm），日本东曹公司；混合色谱标准品：含甲状球蛋白、γ球蛋白、鸡卵清白蛋白、马心肌红蛋白、维生素B12，美国Biorad公司；牛血清白蛋白相对分子质量标准物质、细胞色素C相对分子质量标准物质：中国计量科学研究院；β乳球蛋白：美国Sigma公司。

1．2标准物质溶液和样品溶液的配制

将一瓶混合色谱标准品（以下简称Biorad混标）溶解于10mL流动相中，其中甲状球蛋白、γ球蛋白、鸡卵清白蛋白各含5mg，马心肌红蛋白含量约为2.5mg，维生素B12约为0.5mg。分别称取牛血清白蛋白相对分子质量标准物质、细胞色素C相对分子质量标准物质和β乳球蛋白各约5mg，溶解于10mL流动相［0.05mol／L磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）–0.3mol／L氯化钠溶液］中，配制成混合标准溶液（以下简称混标C）。称量约5mg待测蛋白样品，溶解于10mL流动相中。将Biorad混标、混标C及待测蛋白样品分别用0.45μm的醋酸纤维素过滤膜过滤，上机测定。

1．3标准品的紫外吸收光谱

将相对分子质量标准品配制成适当浓度的溶液，在凝胶色谱仪中可以直接测得各种分离组分的色谱数据，根据测定结果选择220nm作为检测波长。根据所有被分析的标准品和蛋白质样品的光谱数据，选择300～330nm范围的参比波长以获得*佳响应值。

1．4色谱条件

高效凝胶排阻色谱柱：TSKgelG3000SWXL型（300mm×7.8mm）；进样体积：20μL；流动相：0.05mol／L磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）–0.3mol／L氯化钠溶液，流速为1mL／min；检测器：DAD；检测波长：220nm；信号采集时间：15min。

1．5数据处理

采用Agilent1260化学工作站配置的GPCadd-on数据处理软件进行数据处理。在软件中打开标准物质溶液的色谱图，指定相应的色谱峰并输入相应的相对分子质量标准物质的相对分子质量信息，采用线性拟合方法，软件自动生成标准曲线。然后打开样品溶液的色谱图，选定使用的标准曲线及需要计算的相对分子质量分布范围，软件自动计算出样品的相对分子质量（峰值相对分子质量Mp、数均相对分子质量Mn、重均相对分子质量Mw、Z均相对分子质量MZ）及相应的相对分子质量分布。使用色谱图积分面积百分比法可得样品的主组分占可检出组分的比例约为85%。根据软件计算出的相对分子质量及相对分子质量分布情况，该牛血清白蛋白样品中主组分在60～80kDa相对分子质量范围的Mp为7.3211×104Da，其相对分子质量分布指数D在1.0092～1.0096之间，满足D小于1.10的条件，见图1。

2结果与讨论

2．1标准物质和流动相的选择

分别使用混合色谱标准品、牛血清白蛋白相对分子质量标准物质、马心肌红蛋白相对分子质量标准物质、细胞色素C相对分子质量标准物质、β乳球蛋白、铁蛋白、过氧化物酶、鸡卵清白蛋白、核糖核酸酶A，选取3种流动相配比进行试验：T1流动相为0.1mol／L磷酸盐缓冲溶液（pH6.7）–0.1mol／LNa2SO4溶液；T2流动相为0.05mol／L磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）–0.3mol／LNaCl溶液；T3流动相0.1mol／L磷酸盐缓冲溶液（用NaOH溶液调至pH6.8）–0.2mol／LNaCl溶液。将上述标准品分成若干组，分别混合，并在相应的流动相中溶解后进样。

试验发现，过氧化物酶与Biorad混标中的鸡卵清白蛋白、核糖核酸酶A与Biorad混标中的细胞色素C在色谱中的保留体积非常接近而且相对分子量相对偏差不超过10%，所以予以剔除［9］。由于铁蛋白的纯度不佳、维生素B12为非采样点，所以将二者剔除。所选蛋白标准物质在3种流动相条件下线性拟合曲线的相关系数r2分别为0.9883，0.9953，0.9946。

选用Biorad混标和混标C，在T2流动相条件下，分两组进样，可达到基线分离且峰形较好，如图2。相对分子质量对数值y与保留体积x（mL）的线性方程为y=–0.3302x+7.9618，线性相关系数r2为0.9953。

2．2检测波长的选择

使用DAD检测器可直接获得选用蛋白质样品在210～400nm范围内的光谱数据，如图3。由图3可以看出，所有选用的蛋白质样品都在280nm处有吸收峰，而在220nm处的吸光度要远高于280nm处。马心肌红蛋白和细胞色素C在340～400nm附近吸光度逐渐高于280nm处的吸光度。因此选择220nm作为检测波长、300～330nm作为参比波长可以避免负峰的出现和获得较高的灵敏度。

2．3测量精密度和准确度

采用T2流动相和优选的7种蛋白制作标准曲线，对牛血清白蛋白样品主组分中相对分子质量60～80kDa范围的蛋白分布进行测定。连续两天，进行3组平行试验，每组均采用Biorad混标和混标C新制作一条校准曲线。**天进样一组，进样1次，平行进样3针；第二天进两组，每组进样3次，每次平行进样3针。计算测定结果的平均值及组内和组间相对标准偏差，数据见表1。由表1数据计算得该方法组内总平均值为83.410%，相对标准偏差为0.004%～0.014%；组间相对标准偏差为1.89%，选定显著水平α=0.05，经过F检验可以判定3组数据的精密度没有显著差异，属于等精密度测量。测量精密度可以满足一般实验室对牛血清白蛋白的相对分子质量分布测定的要求。

选定显著水平α=0.05；将3组数据进行互相比对，自由度f1–2，f1–3，f2–3分别为10，10，16；根据公式计算合并样本方差Sp(1–2)，Sp(1–3)，Sp(2–3)分别为0.007，0.006，0.004；根据公式计算统计量结果，并查表，结果为t1–2=228.11＞t0.05，10=2.23，t1–2=622.48＞t0.05，10=2.23，t1–2=807.67＞t0.05，16=2.16。经过t检验可判定组间测量结果存在不可忽略的差异，这说明用凝胶排阻色谱法测定牛血清白蛋白相对分子质量分布的方法，在不同组进行测量时存在一定的系统误差，测量结果具有参考价值。

由于目前测量相对分子质量分布没有参考标准，所以对于该方法的准确度评价可以考虑使用校准曲线计算出某种蛋白的相对分子质量与其参考值进行比对。采用牛血清白蛋白相对分子质量标准物质作为样品，连续6天，分6组进样。根据相对分子质量对数值y与保留体积x（mL）的线性方程为y=–0.3302x+7.9618，计算出该样品的Mp，以标准物质证书给定的值66446Da作为Mp的参考值，计算其相对误差，并得出均值的相对误差为7.76%，见表2。结果表明，通过校准曲线计算出的Mp值与参考值有一定程度的偏离，使用该方法对样品分子量的测量具有参考价值。

2．4不同来源的同种蛋白保留时间差异性考察

分别将不同来源和相同来源的牛血清白蛋白质分组进样检测，计算测量结果，并对测量结果进行F检验和t检验［10–11］，检验结果见表3和表4。选定显著水平α=0.05进行双侧F检验和t检验。F检验结果表明，无论是否同种来源的蛋白其测量属于等精度测量。t检验结果表明，分别来自中国计量科学研究院（表3中简称计量院）和Sigma公司（表3中简称Sigma）的牛血清白蛋见白其淋洗体积差异显著；对同种来源的牛血清白蛋白，组1和组2之间的淋洗体积差异不显著，以上实验结果表明，不同来源的同种蛋白，其保留体积（时间）也可能有略微差异，并且这种差异不可忽略。在制作标准曲线时应尽可能采用有证标准物质，否则会增大测量结果的不确定度。