检测及试验方法
实验试剂
甲醇、乙腈，均为色谱纯，德国CNW技术有限公司；乙酸铵、乙酸，色谱纯，ACS美国恩科公司生产；水为实验用三级水。
多菌灵标准品、甲基托布津标准品、百菌清标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司。
弗洛里硅土SPE柱、C18SPE柱、中性氧化铝SPE柱，均为500 mg/6mL，德国Simon Aldrich公司生产。
色谱条件
色谱柱，Agilent Eclipse Plus C18(4.6×250 mm，5μm)，美国安捷伦科技有限公司。流动相：A为10 mmol·L-1乙酸铵水溶液(用乙酸调节pH至4.5)，B为甲醇；检测波长：240 nm，270 nm；柱温：40℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10μL。梯度洗脱程序如表1所示。
标准溶液的配制
精密称取多菌灵、甲基托布津和百菌清标准品适量，用甲醇配制成浓度为1mg.mL-1的标准贮备液。取适量的标准贮备液用甲醇配制成不同浓度的混合标准液。
样品的处理
取代表性样品约10 g，将其剪碎至2 mm×2 mm以下，混匀。准确称取1 g(精确至0.001 g)试样，置于50 mL有盖离心管中，加入20 mL乙腈，超声提取30 min，提取液过滤于圆底烧瓶中，残渣再用10 mL乙腈重复提取一次，过滤。提取液合并后，于旋转蒸发仪中，40℃水浴旋转蒸发至约5 mL，转入预先用乙酸乙酯活化的弗罗里硅土SPE小柱中。再用5 mL乙腈溶液洗涤圆底烧瓶，合并洗涤液加入硅土柱中，然后用5 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1)淋洗小柱两次，收集流出液经40℃水浴旋转蒸发至近干，用甲醇溶解并定容至1 mL，经0.45μm的有机系微孔滤膜过滤，供液相色谱检测。
样品净化条件的选择
皮革样品基质复杂，干扰成分较多，提取溶液需要经过有效净化，避免干扰测定。本实验采用固相萃取技术对样品提取液进行净化，分别考察了中性氧化铝柱、弗洛里硅土柱、C18柱这三种SPE小柱的净化效果，其中弗洛里硅土柱效果*佳；乙腈-乙酸乙酯混合洗脱剂对三种目标物在弗洛里硅土小柱上的洗脱能力优于乙腈、乙酸乙酯、甲醇等单一溶剂，对多菌灵、甲基托布津和百菌清的回收率都达到90%以上。
样品提取条件的选择
甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等溶剂均能提取多菌灵、甲基托布津和百菌清。经实验比较，乙腈同时提取皮革样品中的多菌灵、甲基托布津和百菌清效果*好。所以本实验采用乙腈作为提取溶剂。
色谱条件的优化
紫外检测波长的选择
用多菌灵、甲基托布津和百菌清的标准溶液进行紫外光谱扫描，扫描范围200~800 nm。多菌灵在235 nm和275 nm都有较强的紫外吸收，甲基托布津在229 nm和267 nm有较强的紫外吸收，百菌清在240 nm处有很强的紫外吸收。为保证三种待测物均有较好的响应值，选取240 nm作为百菌清的检测波长，选取270 nm作为多菌灵和甲基托布津的检测波长。DAD光谱图见图1、图2和图3。
色谱柱与流动相的选择
C18液相色谱柱对多菌灵、甲基托布津和百菌清均有较好的保留，可用作液相色谱分析柱。本文选用Agilent Eclipse Plus C18(4.6×250 mm，5μm)色谱柱进行分析。考察了甲醇-水(体积比20∶80)等度洗脱，多菌灵和甲基托布津保留值低，出峰快，均在3分钟之内出峰，两种物质分离不好，易受杂质干扰。实验比较了甲醇-水和甲醇-乙酸铵水溶液两种流动相体系对多菌灵、甲基托布津和百菌清保留时间的影响，发现在甲醇-乙酸铵水溶液流动相中，多菌灵的保留时间由水-甲醇流动相的2.6 min变为3.5 min；甲基托布津由2.9 min变为14.5 min；百菌清由4.7 min变为22.3 min。因此本文选用“1.2”的甲醇-乙酸铵水溶液梯度洗脱程序作为流动相体系，能够更好地将3种目标物质有效地分离，提高色谱柱对目标物质的保留，避免杂质峰的干扰，适合皮革类复杂基质样品的检测。多菌灵、百菌清和甲基托布津标准溶液的液相色谱图见图4和图5。
线性范围、检出限与定量下限
准确配制浓度为0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、15 mg·L-1的多菌灵、甲基托布津和百菌清的混合标准溶液，每个浓度的混合标准液重复测定5次，以平均色谱峰面积为纵坐标，标样质量浓度(mg·L-1)为横坐标绘制标准工作曲线，计算相关系数。多菌灵、甲基托布津和百菌清的线性关系见表2，多菌灵、百菌清和甲基托布津定量下限LOQ(S/N=10)分别为0.06 mg·L-1、0.8 mg·L-1、0.5 mg·L-1。多菌灵、百菌清和甲基托布津的检测限LOD(S/N=3)分别为0.02 mg·L-1、0.24 mg·L-1、0.15 mg·L-1。
回收率与精密度
在空白的皮革样品中添加多菌灵、百菌清和甲基托布津标样，使样品中多菌灵、百菌清和甲基托布津的添加水平分别为1.0、5.0和10.0 mg/kg，每个加标水平做6个回收实验，平均回收率和变异系数(CV)见表3。空白皮革样品中加标色谱图见图6和图7。
