1.范围
本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定。
2.规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
3.原理
用脂肪酶降解试样中的脂肪和不饱和脂肪酸,对于含淀粉试样需先用淀粉酶降解试样中的淀粉,经碱皂化后,用正己烷提取维生素K1。通过液相色谱法分离,柱后还原维生素K1,荧光检测器检测,外标法定量。
4.试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 氢氧化钠溶液(10mol/L):临用前配制。
4.2 95%乙醇。
4.3 饱和氯化钠溶液。
4.4 正己烷:色谱纯。
4.5 无水硫酸钠。
4.6 甲醇:色谱纯。
4.7 二氯甲烷:色谱纯。
4.8 冰醋酸。
4.9 氯化锌。
4.10 无水乙酸钠。
4.11 流动相:甲醇(4.6)900mL,二氯甲烷(4.7)100mL,冰醋酸(4.8)0.3mL,氯化锌(4.9)1.5g,无水乙酸钠(4.10)0.5g,溶解后用0.45μm滤膜过滤。
4.12 淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg。
4.13 脂肪酶:酶活力≥700U/mg。
4.14 锌粉:粒度50μm～70μm。
4.15 维生素K1标准溶液:标准溶液浓度校正方法参见附录A。
4.15.1 维生素K1标准贮备液(2mg/mL):称取0.05g维生素K1标准品(精确到0.1mg),于25mL容量瓶中,用正己烷溶解定容。
4.15.2 维生素K1标准中间液(20μg/mL):取标准贮备液(4.15.1)1mL加正己烷定容至100mL。
5.仪器和设备
5.1 高效液相色谱仪,带有荧光检测器。
5.2 天平:感量为0.1mg。
5.3 分液漏斗:250mL。
5.4 旋转蒸发器。
5.5 恒温空气浴振荡器。
5.6 离心机:转速≥3000转/分钟。
5.7 氮吹仪。
6.分析步骤
6.1 试样处理
6.1.1 含淀粉的试样
称取混合均匀的固体试样约2.5g或液体试样约10g(精确到0.1mg)于三角瓶中,加入0.5g淀粉酶(4.12),用30mL温水溶解。
6.1.2 不含淀粉的试样
称取混合均匀的固体试样约2.5g或液体试样约10g(精确到0.1mg)于三角瓶中,用30mL温水溶解。
6.2 测定液的制备
向上述处理过的试样溶液中加入1g脂肪酶(4.13),于37℃±5℃恒温空气浴振荡器中振荡过夜使其充分酶解。取岀酶解好的试样,加入2nL氢氧化钠溶液(4.1),用50nL乙醇(4.2)将溶液转入250mL的分液漏斗中,充分混匀(必要时加少量饱和氯化钠溶液(4.3))。加入50mL正己烷(4.4)。充分振摇2min,静置分层。放出下层水相于另一个250mL分液漏斗中,留下有机相。向水相中再次加入50mL正己烷再次萃取。合并有机相。用适量蒸馏水洗有杋相两次。将有机相通过无水硫酸钠(4.5)脱水过滤到一个500mL的烧瓶中,在旋转蒸发器上于40℃±2℃下蒸发至近干。用正己烷(4.4)转移残留物到一个10mL试管中,置氮吹仪上于40℃±2℃下吹干,准确加入1mL正己烷(4.4),充分振荡溶解残留物。将试管放入冰箱中在0℃以下冷冻h备用。
6.3 测定
6.3.1 色谱参考条件
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