1 范围
本标准规定了食品中维生素A、维生素E和维生素D的测定方法
本标准**法适用于食品中维生素A和维生素E的测定
本标准第二法适用于食用油、坚果、豆类和辣椒粉等食物中维生素E的测定。
本标准第三法适用于食品中维生素D2和维生素D的测定。
本标准第四法适用于配方食品中维生素D2或维生素D3的测定。
**法食品中维生素A和维生素E的测定反相高效液相色谱法
2 原理
试样中的维生素A及维生素E经皂化(含淀粉先用淀粉酶酶解)、提取、净化、浓缩后,C3。或PFP反相液相色谱柱分离,紫外检测器或荧光检测器检测,外标法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 无水乙醇(C2H5OH):经检查不含醛类物质,检查方法参见A.1
3.1.2 抗坏血酸(C6H3O)
3.1.3 氢氧化钾(KOH)。
3.1.4 乙醚[(CH3CH2)2O]:经检查不含过氧化物,检查方法参见A.2
3.1.5 石油醚(C5H12O2):沸程为30℃~60℃。
3.1.6 无水硫酸钠(Na2SO4)
3.1.7 pH试纸(pH范围1~14)
3.1.8 甲醇(CH3OH):色谱纯。
3.1.9 淀粉酶:活力单位≥100U/mg
3.1.10 2,6-二叔丁基对甲酚(CH2O):简称BHT。
3.2 试剂配制
3.2.1 氢氧化钾溶液(50g/100g):称取50g氢氧化钾,加入50mL水溶解,冷却后,储存于聚乙烯瓶中。
3.2.2 石油醚-乙醚溶液(1+1):量取200mL石油醚,加入200mL乙醚,混匀
3.2.3 有机系过滤头(孔径为0.22m)
3.3 标准品
3.3.1 维生素A标准品 视黄醇(C20H3O,CAS号:68-26-8):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质
3.3.2 维生素E标准品
3.3.2.1 α生育酚(Ca3HO2,CAS号:10191-41-0):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2.2 β生育酚(C23H8O2,CAS号:148-03-8):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2.3 γ-生育酚(C2H3O2,CAS号:54-28-4):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.32.4 δ生育酚(C27H46O2,CAS号:119-13-1):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 维生素Δ标准储备溶液(0.500mg/mL):准确称取25.0mg维生素A标准品,用无水乙醇溶解后,转移入50mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液浓度约为0.500mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中,密封后,在一20℃下避光保存,有效期1个月。临用前将溶液回温至20℃,并进行浓度校正(校正方法参见附录B)
3.4.2 维生素E标准储备溶液(1.00mg/mL):分别准确称取a生育酚、B生育酚、y生育酚和生育酚各50.0mg,用无水乙醇溶解后,转移亼50mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液浓度约为1.00mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中,密封后,在-20℃下避光保存,有效期6个月。临用前将溶液冋温至20℃,并进行浓度校正(校正方法参见附录B)。
3.4.3 维生素A和维生素E混合标准溶液中间液:准确吸取维生素A标准储备溶液1.00m和维生素E标准储备溶液各5.00mL于同一50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,此溶液中维生素A浓度为10.0g/mL,维生素E各生育酚浓度为100μg/mL。在-20℃下避光保存,有效期半个月
3.4.4 维生素A和维生素E标准系列工作溶液:分别准确吸取维生素A和维生素E混合标准溶液中间液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于10mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,该标准系列中维生素A浓度为0.20μg/mL、0.50μg/m、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL,维生素E浓度为2.00μg/m、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL。临用前配制。
4 仪器和设备
4.1 分析天平:感量为0.01mg
4.2 恒温水浴振荡器
4.3 旋转蒸发仪。
4.4 氮吹仪
4.5 紫外分光光度计。
4.6 分液漏斗萃取净化振荡器
4.7 高效液相色谱仪:带紫外检测器或二*管阵列检测器或荧光检测器。
5 分析步骤
5.1 试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定
5.2 试样处理
警示:使用的所有器皿不得含有氧化性物质;分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作;提取过程应在通风柜中操作
5.2.1 皂化
5.2.1.1 不含淀粉样品
称取2g~5g(精确至0.01g)经均质处理的固体试样或50g(精确至0.01g)液体试样于150mL平底烧瓶中,固体试样需加入约20mL温水,混匀,再加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀,加入30mL无水乙醇,加廴10mL~20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于80℃恒温水浴震荡皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温
注:皂化时间一般为30min,如皂化液冷却后,液面有浮油,需要加人适量氢氧化钾溶液,并适当延长皂化时间。
5.2.1.2 含淀粉样品
称取2g~5g(精确至0.01g)经均质处理的固体试样或50g(精确至0.01g)液体样品于150mL平底烧瓶中,固体试样需用约20mL温水混匀,加入0.5g~1g淀粉酶,放入60℃水浴避光恒温振荡30min后,取出,向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀,加入30mL无水乙醇,10mL
20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于80℃恒温水浴振荡皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温。
5.2.2 提取
将皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中,加入50mL石油醚-乙醚混合液,振荡萃取5min,将下层溶液转移至另一250mL的分液漏斗中,加入50mL的混合醚液再次萃取,合并醚层。
注:如只测维生素A与α-生育酚,可用石油醚作提取剂。
5.2.3 洗涤
用约100mL水洗涤醚层,约需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用pH试纸检测下层溶液pH值),去除下层水相。
5.24 浓缩
将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤250mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中,用约15mL石油瞇冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次,并入蒸发瓶内,并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上,于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚液剩下约2mL时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中,定容至刻度。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定
