固定病毒–稀释抗血清法
该病毒中和试验方法主要用于血清抗体滴度的测量。将 100 CCID50/单位体积的病毒分别与连续倍比稀释的病人急性期或恢复期血清混合孵育 1 h 后，把混合液接种于敏感宿主，然后观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况。
实验材料：
具有感染力的病毒（已滴定的标准病毒 100 TCID50 0. 1 ml 或 100 LD50 0. 1 ml）
试剂、试剂盒：
病毒抗体阳性的血清和病毒抗体阴性的血清：急性期或恢复期血清（通常 56℃ 30 min 灭活） 敏感宿主体系：敏感细胞、敏感动物、鸡胚
仪器、耗材：
96 孔细胞培养板
实验步骤：以细胞培养为例
①用细胞维持液连续倍比稀释急性期和恢复期血清；
②取1. 0 ml 不同浓度的稀释血清分别与 1. 0 ml 标准病毒 (100 CCID50/0. 1 m) 混合，置 37℃水浴作用1 h;
③取混合液 0. 2 ml 分别加到细胞已长成单层的 96 孔细胞培养板中，每一稀释度接种 4孔细胞。同时设 4孔正常细胞对照和设 4 孔 100 CCID50/0. 2 ml 作病毒对照；
④设病毒滴度对照。将病毒液连续 10倍稀释后，加到细胞已长成单层的 96 孔细胞培养板中，每个稀释度接种 4孔细胞，每孔加 0. 1 ml。必要时还要设抗体阳性血清对照和抗体阴性血清对照。
⑤将 96 孔细胞培养板置 37℃、 5% CO2 温箱中孵育，每日观察细胞病变效应 (CPE) 。
⑥50% 血清中和终点的计算： 50% 细胞不产生细胞病变 (CPE) 的血清稀释度。根据细胞病变程度，用 Reed-Muench 法计算 50%血清中和终点。
注意事项：
1. 病毒悬液病毒应低温保存，融化后只可使用一次，避免反复冻融，这样会降低病毒的毒力。多次进行同一试验时，应使用同一批冻存的病毒，以减小误差。
2. 抗血清人和动物血清中含有一些非特异性的物质，这些物质可增强抗病毒抗体的中和作用，也可以灭活病毒，通常采用加热的方法破坏这些物质。不同来源的血清灭活温度不尽相同，人、豚鼠血清为 56℃, 兔为 65℃, 时间为 20~30 min。在细胞培养中进行中和试验时，要注意避免使用相同的细胞。
3. 孵育的温度和时间 病毒与抗血清在 0℃时不发生反应， 5℃以上才发生中和反应。通常采用 37℃ 孵育1 h, 一般的病毒即可和抗血清充分反应。但是，一些特殊的病毒在此反应条件下不能充分反应，试验时应根据不同的病毒改变孵育的时间和温度。
固定抗血清–稀释病毒法
实验材料：已知标准的抗病毒血清 (20抗体单位 0. 1 ml)
试剂、试剂盒：已知阴性血清 (56℃ 30 min 灭活） 宿主：敏感细胞、敏感动物、鸡胚
仪器、耗材：细胞培养板、水浴锅、细胞培养箱
实验步骤：
①用细胞维持液连续 10倍稀释病毒分离物10-1~10-8);
②取 0. 6ml不同浓度的病毒稀释液与 0. 6 ml 标准的抗病毒血清混合；
③再取 0.6ml 不同浓度的病毒稀释液与 0. 6 ml 已知的阴性血清混合；
④将混合液置 37℃ 水浴1h, 然后取 0. 2 ml 混合液分别接种于细胞已长成单层的 96孔细胞培养板中，每一稀释度接种 5孔，设 5 孔正常细胞对照；
⑤将细胞培养板置 37℃ 、 5% CO2 温箱中孵育，每日观察细胞病变效应 (CPE) 。
⑥中和试验的病毒 CCID50 的计算：细胞培养中，通常是以病毒的组织半数感染量 (CCID50/单位体积）作为中和反应的终点。而动物试验中，用动物半数致死量 (LD50/单位体积）作为中和反应的终点。中和试验中，抗血清组的 CCID50 与阴性血清组的 CCID50 之差的对数等于或大于2, 才能说明中和试验结果为阳性。
注意事项：
用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清 (20个抗体单位/单位体积）混合、孵育，使二者充分反应，然后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验结果。
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