1.范围
本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素B6的测定方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素B6的测定。
2.规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
3.原理
试样经热水提取等前处理后,经C18色谱柱分离,荧光检测器检测,外标法定量测定维生素B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)的含量。
4.试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg。
4.2 辛烷磺酸钠:优级纯。
4.3 冰乙酸:优级纯。
4.4 甲醇:色谱纯。
4.5 三乙胺:色谱纯。
4.6 盐酸溶液(5.0mol/L,0.1mol/L)。
4.7 氢氧化钠溶液(5.0mol/L,0.1mol/L)
4.8 标准溶液
4.8.1 维生素B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)标准贮备液(1mg/mL):称取0.05g(精确至0.0001g)吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准品,分别置于50mL容量瓶中,用水溶解定容。
4.8.2 维生素B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)混合标准中间液(20μg/mL):分别准确吸取吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准贮备液(4.8.1)1mL至50mL容量瓶中,用水定容。
4.8.3 维生素B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)混合标准系列测定液:分别准确吸取维生素B6。混合标准中间液(4.8.2)0.0mL、1.0mL、2.0mL、30mL、50mL,至100mL容量瓶中,用水定容。该标准系列浓度分别为0.00μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、1.00μg/mL。临用前配制。
5.仪器和设备
5.1 超声波振荡器。
5.2 高效液相色谱仪,带荧光检测器。
5.3 天平:感量为0.1mg。
5.4 pH计:精度为0.01。
5.5 培养箱:30℃～80℃。
6.分析步骤
6.1 试样预处理
6.1.1 含淀粉的试样:称取混合均匀固体试样约5.0g(精确至0.0001g),加入约25mL45℃～50℃的水,或称取混合均匀液体试样约20.0g(精确至0.0001g)于150mL锥形瓶中。加入约0.5g淀粉酶(4.1),混匀后向锥形瓶中充氮,盖上瓶塞,置50℃～60℃培养箱内约30min。取岀冷却至室温。
6.1.2 不含淀粉的试样:称取混合均匀固体试样约5.0g(精确至0.0001g),加入约25mL45℃～50℃的水,或称取混合均匀液体试样约20.0g(精确至.0001g)于150mL锥形瓶中。混匀并充分溶解,静置5min～10min,冷却至室温。
6.2 待测液的制备
6.2.1 用盐酸溶液(4.6)调节试样溶液的pH值至1.7±0.1,放置约1min。再用氢氧化钠溶液(4.7)调节试样溶液的pH值至4.5±0.1。
6.2.2 将试样溶液转移至50mL容量瓶中,用水冲洗锥形瓶。洗液合并于50mL容量瓶中,用水定容至50mL。
6.2.3 把上述容量瓶放入超声波振荡器中,超声振荡约10min。
6.2.4 另取50mL三角瓶,上面放入三角漏斗和滤纸,把超声波振荡的试样溶液倒入其中,自然过滤。滤液再经0.45μm微孔滤膜加压过滤,用试管收集,即为试样待测液。
6.3 参考色谱条件
色谱柱:C18柱(粒径5μm,150mm×4.6mm)或同等性能的色谱柱。
流动相:甲醇(4.4)50mL,辛烷磺酸钠(4.2)2.0g,三乙胺(4.5)2.5mL,用水溶解并定容到1000mL后,用冰乙酸(4.3)调pH至3.0±0.1,再经0.45μm微孔滤膜加压过滤。
流速:1.0mL/min。
检测波长:激发波长293nm,发射波长395nm。
进样量:10μL。
6.4 定量分析
6.4.1 标准曲线绘制
将维生素B6混合标准系列测定液(4.8.3)依次进行色谱测定(其标准样品色谱图参见附录A中图A.1)。记录各组分的色谱峰面积或峰髙,以峰面积或峰髙为纵坐标,以标准测定液的浓度为横坐标,绘制标准曲线。
6.4.2 试样测定
将试样待测液(6.2.4)进行色谱测定。记录各组分色谱峰面积或峰髙,根据标准曲线计算岀试样待测液中维生素B6各组分的浓度ci。
7 分析结果的表述
7.1 试样中维生素B各组分的含量的计算
试样中维生素B6各组分的含量按式(1)计算：
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