含量测量是核酸测量的首要问题，世界工业先进国家计量机构均已针对核酸含量测量开展了基础研究和应用研究。核酸含量测量应用广泛，包括实时定量PCR技术、基因芯片、电化学传感器和纳米技术等。这些技术领域质控体系的建立，需要依照权威测量和计量方法研制相应的标准物质，通过标准物质的使用保证核酸测量量值的溯源与传递。
目前国际上现有的具有明确溯源途径的高准确性核酸测量方法有酶解DNA产物的液相色谱–串联同位素稀释质谱方法HPLC–IDMS[1–4]和DNA中磷元素的电感耦合等离子体发射光谱法ICP–OES[5–7]。
DNA酶解法可适用于长片段核酸，但依赖于DNA水解酶的活性，而酶活性受酶解底物浓度的影响[8]。遇到核酸卷曲、核酸与蛋白质结合[9]、碱基修饰[10]等因素造成的特殊空间构象时，核酸水解酶无法进入而无法水解[8]。酶解反应使DNA测量体系内混入大量的蛋白质、无机盐、两性电解质等物质，纯化过程容易导致DNA损失。文献报道，DNA酶解反应容易反应不完全，导致*终测量结果偏低[10]。DNA中磷元素的电感耦合等离子体光谱法(ICP–OES)适用于短片段、纯度很高的DNA样品。如果DNA测量体系中混有其它元素状态的磷，如无机盐中的磷元素，则会造成DNA测量结果偏高[5]。
加热可使得某些带修饰的碱基从DNA骨架上解离出来成为游离碱基[11]。在强酸如HCl条件下，DNA上的碱基与核糖连接的糖苷键断裂，形成游离碱基[12]，但是容易产生副产物。弱酸(如甲酸)在加热条件下可使得DNA上腺嘌呤和鸟嘌呤及其修饰加合物解离为游离碱基[13–14]，该过程也可解离出游离胞嘧啶和甲基胞嘧啶，用于DNA甲基化水平研究[15]。在此基础上，笔者建立了DNA水解产物的HPLC–IDMS定量方法。
核酸的酸水解方法有以下优点：
(1)酸解反应耗时较短，反应充分;
(2)酸解切断的是碱基与核糖之间的糖苷键[13]，不受DNA长度、序列、DNA上结合的蛋白质等因素的影响，水解过程进行较充分;
(3)酸解反应不引入杂质，只有甲酸中携带的痕量金属离子，易于采用液相色谱串联同位素稀释质谱的分离分析。然而酸解法也有一定的缺点，高浓度强酸可能使DNA的水解产生其它反应副产物，可能造成碱基进一步降解[16]。因此需要利用选择酸的类型、酸的浓度、酸解时间与温度，准确控制酸水解效率，以实现DNA含量的准确测量。
噬菌体λDNA是一种广泛应用的核酸含量标准品，常用于DNA紫外或荧光定量方法的校准。噬菌体λDNA的提取纯化过程需要先分离病毒颗粒，因此很少受到细菌本身基因组DNA和RNA的污染，可以获得较纯净的噬菌体DNA[17]，适合作为标准物质候选物。
1实验部分
1.1主要仪器与试剂
水浴锅：DK–8D型，上海一恒科学仪器有限公司;
pH计：Origin3Star型，美国ThermoScientific公司;
旋涡振荡仪：MS3型，德国IKA公司;
真空干燥箱：DZF–6050型，上海精宏实验设备有限公司;
恒温烘箱：UFE500型，德国Memmert公司;
离心机：3–15K型，美国Sigma公司;
纯水机：MilliQ型，美国Millipore公司;
分析天平：CP324S型，感量为0.01mg，德国Sartorius公司;
精密分析天平：UMX2型，感量为0.1μg，瑞士MettlerToledo公司;
电喷雾三重四级杆质谱仪：TSQVantage型，美国ThermoScientific公司;
SDS、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、无机酸、无机盐：分析纯或优级纯;
乙腈、甲醇：色谱醇，美国J.T.Baker公司;
纯度标准物质：自制，分别是腺嘌呤(Ade)[纯度为(99.40±0.68)%，k=2]，胞嘧啶(Cyt)[纯度为(99.58±0.72)%，k=2]，鸟嘌呤(Gua)[纯度为(99.96±0.18)%，k=2]，胸腺嘧啶(Thy)[纯度为(99.67±0.24)%，k=2]。其中腺嘌呤和胞嘧啶分别采用电位滴定法定值，量值溯源至酸碱国家基准，鸟嘌呤和胸腺嘧啶采用液相色谱面积归一化法定值;
同位素标记物：13C，15N双标记碱基，同位素标记腺嘌呤(L-Ade)化学式为1，3-15N298%，同位素标记胞嘧啶(L-Cyt)化学式为2，4-13C2，15N3(99%C，98%N)，同位素标记鸟嘌呤(L-Gua)化学式为8-13C，7，9-15N2(98%C，98%N)，同位素标记胸腺嘧啶(L-Thy)化学式为1，3-15N2，98%，均购自剑桥同位素实验室(CambridgeIsotopeLabotory)公司。
1.2仪器工作条件
1.2.1色谱条件
色谱柱：AcqurityUPLCHSST3色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm，美国Waters公司);
流动相：A为5mmol/LNH4Ac(0.1%HAc，pH4.0)，B为乙腈,水相配制后用0.45μm滤膜抽滤，并超声脱气;
柱温：30℃;进样体积：3μL;
流速：120μL/min;梯度洗脱：0～9min99%A，9～9.5min99%～80%A，9.5～12.5min80%A,12.5～13min80%～99%A，13～18min99%A。
1.2.2质谱条件
正电模式;喷雾电压：3.0kV;雾化气：N2;雾化气温度：200℃;鞘气压力传感器参数：20arb;辅助气压力传感器参数：5arb;毛细管温度：350℃;碰撞气：Ar;一级质谱扫描宽度(m/z)：0.002;扫描时间：0.1s;一级质谱半峰宽(FWHW)：0.7;二级质谱半峰宽：0.7;微扫描时间：1ms。质谱多反应监测模式(MRM)的样品离子监测条件(包括同位素碱基标记物)见表1。按质谱仪说明书配制含有咖啡因、MRFA(多聚酪氨酸短肽)和MLtramarkl621的质量轴校准液，完成质谱仪的校准。
1.3标准溶液和样品溶液的配制
称取约1mg碱基和同位素标记的碱基，分别溶于10mL去离子水中，配制成标准储备液。Gua和L-Gua不易溶于水，溶于体积分数3%的盐酸溶液中，然后配制成混合标准品和混合同位素标记内标品。根据λDNA用HPLC外标法测得的浓度，在溶液中添加约等量的混合同位素标记内标品，同时配制与样品浓度近似的碱基与同位素标记碱基质量比值约为0.90和1.10的高标和低标溶液。
1.4DNA水解
将基因组DNA含量标准物质候选物冻干粉溶于100μL水，在λDNA溶液中添加与其组成成分核苷酸含量相近的标记核苷酸混合物。量取100μL样品溶液于安瓿瓶中，真空干燥箱抽干。加入200μL甲酸水溶液(体积分数为88%)，充氮气，封口。在170℃恒温烘箱内反应30min，冷却后用真空干燥箱抽干，量取加入100μL0.1mol/L盐酸溶解，充分溶解混匀，溶液于4℃下保存。
1.5IDMS法碱基含量的计算
针对每一种碱基：
式中：
c——碱基质量分数;
h——水解效率，%;
P——碱基标准物质的纯度，%;
mr——样品中碱基同位素标记物的质量，g;
Rs——样品中碱基与碱基标记物的峰面积比;
I1——高标溶液碱基与碱基标记物的质量比;
I2——低标溶液碱基与碱基标记物的质量比;
R1——高标溶液碱基与碱基标记物的峰面积比;
R2——低标溶液碱基与碱基标记物的峰面积比;
m——样品质量，g。
1.6λDNA含量的计算
由于λDNA是一个具有49.5kb长度的双链闭环DNA。Cyt，Gua，Thy，Ade4种碱基质量分数分别为8.96%，12.19%，10.23%，10.97%，根据4种碱基含量计算得λDNA总质量，取平均值，得到同位素稀释碱基法测量DNA质量的值。
2结果与讨论
2.1DNA水解条件的优化
分别用5%盐酸溶液于110℃水解24～48h，用88%甲酸水溶液于140℃水解2～16h，用88%甲酸水溶液于170℃水解15min～4h[13–14]。试验结果表明，盐酸水解产物杂质较多;甲酸140℃水解胸腺嘧啶核苷一磷酸的水解不完全;甲酸170℃水解效果较好，水解反应完全。用88%甲酸水溶液于170℃水解30min回收率满足要求，水解产物中4种碱基保持稳定，因此水解条件优化为88%甲酸水溶液于170℃水解30min。
2.2水解效率
根据核苷酸和基因组DNA水解实验的回收率计算酸水解回收率。微生物基因组DNA提取样品中定量加入已知浓度的5种碱基混合物质控品，以1.4步骤水解样品并进行测定，重复测量7个样品，计算回收率，结果表明4种待测物碱基的回收率都在95%以上，水解效率不确定度不大于0.8%。经过t检验，4种dNMP溶液与λgDNA溶液添加dNMP溶液后水解测量的回收率无显著性差异。另外，经过Picogreen荧光染料实验，水解产物没有出现荧光反应，说明水解产物中已不含有双链DNA，即说明水解反应完全。
2.3色谱与质谱参数的优化
测试不同NH4Ac溶液浓度和不同pH值条件下4种碱基的分离效果，结果表明，pH值越大，碱基保留时间越长;有机相比例越高，碱基保留时间越短。考虑出峰时间、色谱柱的耐受性和流动相对质谱的影响，确定了1.2.1色谱条件。配制0.01mg/g同位素标记的碱基和非标记碱基的混合物，进行流动注射，选定合适的喷雾电压和毛细管温度，并且优化S-lens和碎裂CID电压，考虑质谱的扫描速度、分析时间，获得尽可能大的信号强度，确定了1.2.2质谱条件。利用样品与同位素标记物混合后水解的产物进行HPLC–IDMS实验，样品总离子流图和子离子流图分别见图1~图5。
2.4样品中碱基含量的同位素稀释质谱法测定
取15支λDNA冻干粉样品，称量后溶于100μL去离子水中，然后量取100μL样品溶液，加入100μL同位素标记混合样，充分混匀。参照1.4步骤进行实验，结果列于表2，由表2可知，4种碱基测量结果的相对标准偏差都在5%以内。
按照1.6λDNA计算方法，依据不同核苷酸在整个λDNA序列中的比例计算λDNA含量，将4种核苷酸碱基推算所得DNA含量取平均值，并与数字PCR(dPCR)测量结果相比较[18]，结果见图6。λDNA的测量结果为每支(2.51±0.06)μg
(k=2)。由图6可见，两种不同原理的测量方法所得结果近似，测量值在不确定度范围内。
