DHA和EPA因具有预防动脉硬化，防止血栓形成等功能［1］而被广泛应用于保健行业。其中DHA能够补脑健脑，提高视力，是大脑、视网膜神经系统中磷脂的主要成分，它对婴幼儿智力与视力的发育有重要作用［2］。目前DHA，EPA的检测方法主要有甲酯衍生化气相色谱法［3］、高效液相色谱法［4］、薄层色谱法［5］等。笔者参照文献建立了毛细管色谱法分析鱼油保健品中功效成分DHA，EPA的含量，并参照国家规定方法［6］检测DHA，EPA的稳定性，在鱼油保健食品检测中，毛细管色谱法与填充柱气相色谱法相比具有分离度高、选择性好、灵敏度高［7］等特点。
1实验部分
1．1主要仪器与试剂
气相色谱仪：CP–3800型，带氢火焰离子化检测器，美国Varian公司；氢氧化钾–甲醇溶液：1.0mol／L；盐酸–甲醇溶液：2.0mol／L；三氟化硼–甲醇溶液：14%～16%；脂肪酸标准品EPA，DHA甲酯：纯度为99%，美国Sigma公司；饱和氯化钠溶液：分析纯；正庚烷：分析纯；鱼油样品：某品牌鱼油软胶囊。
1．2色谱条件
色谱柱：DB–WAX毛细管柱（30m×0.530mm，1.00μm）；载气：高纯氮；载气流速：15mL／min；柱温采用程序升温方式：初始温度170℃，保持3min，以6℃／min升至210℃，保持14min。进样口温度：260℃；FID检测器温度：300℃；分流比为10∶1；进样量：1μL。
2结果与讨论
2．1实验条件优化
2.1.1柱型选择
实验比较了填充柱、OV–101、SE–54、OV–17、DB–WAX柱的分离效果，结果表明，填充柱柱效低；OV-101，SE-54，OV-17柱分离效果差，不能满足实验要求；DB–WAX柱其柱内涂有高*性固定液且交联，分离效能高，有较高的灵敏度。考虑到柱容量问题，选用0.53mmDB–WAX型色谱柱，某鱼油样品色谱图如图1所示。
2.1.2甲酯化方法
甲酯衍生化处理的目的是将脂肪酸各种酯转化为甲酯，便于样液汽化，在气相色谱柱上得到有效分离。甲酯化常用方法有三氟化硼–甲醇溶液甲酯化法［7］、盐酸–甲醇溶液甲酯化法［8］和氢氧化钠–甲醇溶液甲酯化法［9］。(1)三氟化硼–甲醇甲酯化法：称取约0.1g的鱼油样品，置于离心管中，加入2mL1.0mol／L氢氧化钾–甲醇溶液，于65℃水浴加热10min，期间振揺3次，至油滴完全消失。冷却后加入2mL14%三氟化硼–甲醇溶液，于55℃继续水浴加热10
min。冷却后加入5.00mL正庚烷，再加入2mL饱和食盐水，振摇1min，以3000r／min离心10min分层，取上清液供气相色谱测定。(2)盐酸–甲醇甲酯化法：称取约0.1g的鱼油样品，置于离心管中，加入2mL1.0mol／L氢氧化钾–甲醇溶液，于65℃水浴加热10min，期间振揺3次左右，至油滴完全消失。冷却后加入2mL2mol／L的盐酸–甲醇溶液，下同(1)。(3)氢氧化钾–甲醇甲酯法：取约0.1g的鱼油样品，置于离心管中，加入2mL1.0mol／L氢氧化钾–甲醇溶液，于65℃水浴加热15min，期间振揺3次左右，至油滴完全消失冷却后同(1)操作。不同甲酯化方法测定结果见表1。由表1可知，氢氧化钾–甲醇甲酯化方法面积小,说明不能将样品完全甲酯化；而三氟化硼–甲醇溶液与盐酸–甲醇溶液对样品甲酯化效果好，且差异很小，制备盐酸–甲醇溶液麻烦且不稳定，因此笔者采用三氟化硼–甲醇甲酯化方法对样品进行处理，方法操作简便。值得注意的是三氟化硼有剧毒，操作时需要在通风橱里操作，三氟化硼–甲醇溶液需冷藏保存。
2.1.3甲酯化时间
称取约0.1g的鱼油样品5份，置于具塞磨口离心管中，加入2mL1.0mol／L氢氧化钾–甲醇溶液，65℃水浴加热10min，期间振揺3次左右，至油滴完全消失。冷却后加入2mL14%三氟化硼–甲醇溶液，甲酯化反应时间分别为5，8，10，15，20min，下同2.1.2(1)。平行测定3次，取其平均值,结果见表2。
由表2可知，甲酯化反应8min后，峰面积基本不变，说明样品在8min甲酯化反应已完全。实验选择甲酯化时间为10min。
2.1.4样品甲酯化溶液的稳定性
称取鱼油样品约0.1g，按甲酯化方法处理后，分别在室温放置2，4，6，8，12h；在冷藏条件下放置1，2，3d，进行6次平行测定。结果表明，室温放置条件下峰面积测定结果随时间变化稍有提高；冷藏状态下峰面积测定结果稳定，说明样品甲酯化后冷藏状态下放置至少在3d内稳定。
2.1.5载气流速及分流比
试验发现，当载气流速为30mL／min或50mL／min时，一些组分分离差；流速为10，5mL／min时，样品内各组分分离效果好但分析时间长(如流速为10mL／min时分析时间为32.3min)；流速为15mL／min时分析时间为21.7min。因此实验选择载气流速为15mL／min。取适量样品按照2.1.2(1)方法处理，分别在分流比为3∶1，5∶1，10∶1，20∶1，30∶1的条件下进样检测。当分流比为10∶1时，能获得较好的分离效果和重现性。实验选择分流比为10∶1。
2.1.6进样口温度及柱温
样品甲酯化后，分别在进样口温度为160，180，200，220，240，260，300℃时进样测定。当进样口温度为260，280，300℃时，峰面积大，峰型尖锐。考虑到温度过高可能导致脂肪酸甲酯分子中双键断裂，230℃以下峰面积偏小挥发不完全，选择进样口温度为260℃。取适量样品按照2.1.2(1)方法进行处理，分别在160，180，200，220℃恒温和120℃→210℃，150℃→210℃，170℃→210℃程序升温（初温保持3min，升温速率为6.0℃/min）条件下进样检测，选择*佳柱温条件。结果表明，柱温恒温160℃时分离效果好，分析时间为2h；恒温180℃时分析时间为61min，有些组分分离不好；恒温200℃时，分析时间为24min，分离效果差，不能满足分离要求。170℃→210℃程序升温条件分离效果好，分析时间21.6min，为*佳柱温条件。
2．2标准曲线方程
分别将20.0mg／mL的脂肪酸甲酯EPA标准溶液和DHA标准溶液用正庚烷逐级稀释成质量浓度为20.0，10.0，4.0，2.0，1.0，0.5，0.25，0.125mg／mL的系列标准工作溶液，在选择色谱条件下进行测定，每个浓度测定3次，取峰面积平均值。分别以EPA和DHA的峰面积（Y）对质量浓度（X，mg／mL）绘制标准曲线，线性方程、相关系数见表3。以S／N=3确定方法检出限，EPA质量检出限为0.6ng，DHA质量检出限为1.2ng。
2．3检出限
以S／N=3确定方法检出限，EPA质量检出限为0.6ng，DHA质量检出限为1.2ng。
2．4回收率和精密度试验
取鱼油样品按照2.1.2(1)方法处理后，进样测定，重复6天，每天重复测定6次。考察方法日内重复性和日间重现性。EPA日内精密度为1.92%，日间精密度为3.26%；DHA日内精密度为1.21%，日间精密度为2.42%。向已知浓度的样品溶液中分别加入一定量的低、中、高浓度的EPA，DHA标准溶液，按2.1.2(1)甲酯化后进样测定，每个浓度重复6次。回收率结果见表4。由表4可知，EPA，DHA回收率分别为96.1％，97.8%，相对标准偏差小于3%，说明该方法重现性较好，精密度、准确度高。
2．5样品的稳定性试验
根据卫生部文件对产品保质期规定［6］进行稳定性试验，即采用人工模拟条件进行试验。产品保存温度为37～38℃，相对湿度为70%～80%。分别在人工模拟条件下保存0，30，60，90d后，对3批样品取样，甲酯化后进样分析，测定结果列于表5。由表5可知，样品中DHA，EPA含量随时间变化小，模拟条件90d后样品中EPA,DHA含量约为当天(0d)所测含量的95%以上，表明鱼油中功效成分DHA与EPA含量基本稳定。
2．6样品测定
按2.1.2(1)方法对8个日常送检的鱼油样品甲酯化后，在1.2色谱条件下进行测定，结果见表6。由表6可知，DHA含量在7.45%～41.03%之间，EPA含量在7.98%～71.78%之间，这8个样品均为含DHA，EPA较丰富的鱼油食品。
2．7面积归一法与外标法结果比较
按面积归一法与外标法计算样品中DHA，EPA的含量，结果见表7。
由表7可知，外标法与面积归一法计算结果相近，外标法计算结果变化较大，是由于进样量为1.0μL，进样要求高，有误差产生，导致样品中各组分的峰面积有变化；面积归一法不受进样量的影响。目前国内外采用气相色谱法测定脂肪酸时定量法主要有外标法［8］、内标法［9］及面积归一法［10］。国际上测定DHA或其它脂肪酸含量采用AOACOfficialMethod991.39(气相色谱法微胶囊鱼油与甲酯乙酯鱼油中脂肪酸的测定)、AOACOfficialMethod996.06(食品中脂肪酸的测定)时，用内标法定量。GB／T17377采用面积归一法测定脂肪酸含量［10］，面积归一法要求各组分衍生化完全，且必须出峰，但对标准物质纯度要求不高；外标法及内标法均要求标准物质纯度高，而且内标法要求内标物是被测物中所不含有的组分并且性质相似。
3结语
采用毛细管气相色谱法测定鱼油中DHA和EPA的含量，该法准确、简便，重现性好，可用于鱼油类食品中脂肪酸的测定。
