液相色谱法测定大豆分离蛋白中的三聚氰胺

大豆分离蛋白又称为等电点蛋白粉，它是指除去大豆中油脂、可溶性及不可溶性碳水化合物后的大豆蛋白质。大豆分离蛋白中蛋白质含量高达90%以上，由于其蛋白纯度高，是具有加工功能性的食品添加用的中间原料，近年来被广泛应用于肉食品、乳制品、冷食冷饮、焙烤食品及保健食品等［1］。自从2007年美国宠物食品污染事件和2008年三鹿奶粉污染事件［2］之后，为了防止在食品或者食品原料（比如大豆分离蛋白）中人为加入三聚氰胺这类食品安全事件的发生，我国相关部门加大了对所有列入法检目录的植物源蛋白类产品的监管力度，重点进行三聚氰胺项目检测，凡发现三聚氰胺的，一不得出口，也不得在国内销售。虽然我国已经颁布了数项三聚氰胺检测标准［3–6］，却没有适用于大豆分离蛋白产品的检测标准。适用范围相对接近的GB／T22288–2008也仅限于小麦粉、玉米粉和大米粉中三聚氰胺的检测，并且检测器为气相色谱串联质谱仪，价格昂贵，检测成本高。基于GB／T22388–2008和NY／T1372–2007，笔者采用高效液相色谱法测定大豆分离蛋白中三聚氰胺的含量，对检测过程中存在的基质效应进行了讨论，为建立检测标准提供参考。

1实验部分

1．1主要仪器与试剂

液相色谱仪：Ultimate3000型，配UV检测器，美国赛默飞公司；台式低速离心机：TDZ5–WS型，湖南湘仪公司；超声波清洗器：KQ500E型，江苏昆山超声仪器公司；涡旋震荡器：VORTEX–GENIE2型，美国ScientificIndustries公司；氮吹仪：TTL–DCII型，北京同泰联公司；聚合物阳离子交换固相萃取柱：60mg／3mL，安捷伦科技公司；三聚氰胺标准品：迪马科技公司；三聚氰胺标准储备溶液：1000mg／L，取适量三聚氰胺标准品，用色谱纯级甲醇–水（体积比1∶1）的混合溶液配制而成；辛烷磺酸钠、甲醇、乙腈：色谱纯；柠檬酸、乙酸铅、三氯乙酸、甲醇、盐酸、氨水：分析纯；离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加水定容至1L，摇匀。

1．2样品前处理

(1)提取。称取混合均匀的样品2.00g置于100mL具塞离心管中，加入1%三氯乙酸溶液25mL，饱和乙酸铅溶液2mL，涡旋1min混匀，超声提取30min，以5000r／min离心10min，吸取上清液待过滤。(2)净化。依次用3mL甲醇、3mL水活化聚合物阳离子交换固相萃取柱，取5mL滤液进行固相萃取，用3mL0.1moL／mL盐酸溶液、3mL甲醇淋洗，然后用6mL5%氨化甲醇[氨水–甲醇（体积比5∶95）]溶液洗脱，收集洗脱液，在55℃条件下氮气吹干。以流动相定容至1mL，经0.22μm水相过滤器过滤后，进样测定。

1．3色谱条件

色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：离子对试剂缓冲液–乙腈（体积比80∶20），流速为1mL／min；柱温：40℃；波长：240nm；进样量：20μL。

1．4基质匹配标准溶液配制

移取适量三聚氰胺标准储备溶液以甲醇–水（体积比1∶1）溶液逐级稀释，得到浓度为0.4，0.8，4，8，40mg／L的系列标准工作溶液。取系列标准工作溶液各1mL，分别加入到经过提取、净化后的6mL空白样品中，氮气吹干，流动相定容至1mL，即为基质匹配标准溶液。

2结果与讨论

2．1样品前处理条件的选择

三聚氰胺溶于甲醇、乙酸，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐，实验表明，采用甲醇作为提取溶剂时，脂肪同时被提取出来，经紫外检测时，出现大量杂质峰，从而干扰、掩盖目标峰；采用三氯乙酸溶液提取可获得较好的效果，能够去除大部分蛋白质和脂肪，但仍有少量蛋白质残留在提取液中。因此向提取液中加入2mL饱和乙酸铅溶液，即可将蛋白质完全沉淀。样品经1%三氯乙酸和饱和乙酸铅提取，再采用阳离子交换固相萃取小柱净化，能够有效沉淀蛋白、除去脂肪和杂质。三聚氰胺标准溶液和大豆分离蛋白样品加标后的液相色谱图分别见图1、图2。

2．2基质效应的影响

在测定添加回收率时，与标准溶液比较2，4，20mg／kg3个浓度水平的回收率仅为72.88%～82.50%，结果偏低，经分析可能是基质效应影响的结果。为验证大豆分离蛋白中基质效应对三聚氰胺的检测是否产生影响，对基质匹配标准溶液和标准溶液进行比较，结果见表1、表2。由表1、表2可知，各浓度基质匹配标准溶液的峰面积较标准溶液的峰面积平均减小9.18%左右，大豆分离蛋白中的基质效应较为明显，所以大豆分离蛋白对于三聚氰胺表现为抑制作用，对于回收率的影响也相应表现为抑制效应，导致回收率结果偏低。因此以基质匹配标准工作溶液计算回收率，各浓度提高12%。因此在检测大豆分离蛋白中三聚氰胺含量时，必须考虑基质效应的影响，用基质匹配标准工作溶液进行定量分析。

2．3工作曲线方程及检出限

实验采用外标法定量，将浓度为1000mg／L的三聚氰胺标准储备液用甲醇－水（体积比1∶1）溶液逐级稀释得到浓度为0.4，0.8，4，8，40mg／L的系列标准工作溶液和基质匹配标准工作溶液，进行色谱测定，以质量浓度（mg／L）为横坐标、以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程、相关系数见表3。

由表3可知，标准工作溶液和基质匹配标准工作溶液的标准曲线线性均较好，相关系数相差很小，因此可以使用基质匹配标准工作溶液代替标准工作溶液进行定量计算。按3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限。经计算三聚氰胺在大豆分离蛋白中的定量限为2mg／kg，检出限为0.6mg／kg。

2．4加标回收率和精密度试验

以大豆分离蛋白空白样品（经过检测，不含有三聚氰胺）作为测试样品，在2，4，20mg／kg3个浓度水平上进行添加回收试验，按1.2方法进行提取、净化，在相同条件下测试6个平行样，测定结果见表4。由表4可知，三聚氰胺的回收率为78.82%～92.95%，相对标准偏差小于2%。

3结语

在不具备气相色谱串联质谱检测器和液相色谱串联质谱检测器的条件下，用液相色谱（紫外检测器）法检测大豆分离蛋白中三聚氰胺的含量，该方法经济，结果准确可靠，能够满足大部分大豆分离蛋白生产企业的自检要求及检测机构的检验要求。