香兰素与乙基香兰素是人工合成的香精，可增强食品口感，使其清香宜人［1］，是食品添加剂行业中不可缺少的重要原料，可直接应用于化妆品、香皂、香烟、糕点、糖果、饼干、奶粉以及烘烤食品中［2］。但大剂量使用香兰素可以导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝、肾，对人体有较大危害。常见香兰素与乙基香兰素的分析方法有气相色谱法［3–4］、分光光度法［5–6］、高效液相色谱（HPLC）法［7］、液相色谱–质谱联用［8］及其它方法［9–11］。笔者采用HPLC法同时测定香兰素与乙基香兰素，通过对牛奶样品的简单处理和流动相的优化，使得方法操作简单，精密度高，重复性好，可用于牛奶中香兰素与乙基香兰素的日常检测。
1.2标准溶液的制备
分别取香兰素与乙基香兰素标准样品各1mL，以甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，配制成100mg/L的混合标准储备液。精密移取0.5mL混合标准储备液，以流动相溶解并定容于100mL容量瓶中，配制成0.5mg/L的混合标准溶液，过滤，备用。
1.3样品溶液的配制
称取牛奶样品5g，以25mL50℃热水溶解，超声10min，用5mol/L盐酸溶液调节至pH1.7，置5min，再用2mol/LNaOH溶液调节至pH4.5，此时溶液变为悬浊液，将此悬浊液转移至50mL容量瓶中，用纯水定容至标线后倒入漏斗，用快速定性滤纸过滤，弃去初滤液，收集中间滤液，充分摇匀，过滤，备用。
1.4色谱条件
流动相：甲醇–0.01mol/L磷酸溶液(体积比为30∶70);流速：1.0mL/min;检测波长：276nm;柱温：30℃;进样量：20μL。
2结果与讨论
2.1流动相组成
考察了乙腈–乙酸、乙腈–磷酸二氢钾、甲醇–磷酸等流动相，虽然乙腈的洗脱能力强于甲醇，但其毒性较大，而且香兰素与乙腈香兰素的色谱峰形、分离度均不符合分析要求;而用甲醇–磷酸体系可以得到标准对称的色谱峰形，因此选择甲醇–磷酸体系作为流动相。
2.2前处理方法
牛奶中的蛋白质含量较高，因此样品要先用50℃热水超声提取，再经酸沉淀蛋白后进行测定。实验结果表明：本方法加标回收率大于98%，且操作简单，可以满足牛奶中香兰素与乙基香兰素的检测要求。
2.3色谱图
在1.4色谱条件下香兰素与乙基香兰素标准溶液及牛奶样品的高效液相色谱图见图1，由图1可知，香兰素与乙基香兰素分离良好、峰形对称，符合分析要求。
2.4精密度试验
精密吸取香兰素、乙基香兰素混合标准溶液20μL，按照1.4色谱条件连续进样6次，分别测定香兰素和乙基香兰素的色谱峰面积，测定结果列于表1。由表1可知，香兰素与乙基香兰素色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为1.09%，0.89%，表明仪器的精密度良好。
2.5线性关系、检出限
分别精密吸取混合标准溶液0.05，0.1，0.2，0.5，1.0mL于10mL容量瓶中，以流动相稀释至标线，摇匀，制得不同浓度的混合标准溶液，分别精密吸取20μL，按1.4色谱条件进样测定色谱峰面积，以标准品浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，进行线性回归，在0.5～10μg/mL的进样范围内，香兰素的线性方程为Y=6.656×10–6X+0.193，r2=0.9997;乙基香兰素的线性方程为Y=8.022×10–6X+0.194，r2=0.9997，表明二者浓度与色谱峰面积线性关系良好。将混合标准溶液以不同倍数稀释后进行测定，以峰高为基线噪音3倍时的质量浓度为检出限，测得香兰素和乙基香兰素的检出限分别为5.68μg/L和12.8μg/L。
2.6重复性试验
精密称取同一牛奶样品6份，照上述样品制备方法制备，按1.4色谱条件进样测定香兰素与乙基香兰素的含量，测定结果见表2。由表2可知，牛奶样品中香兰素与乙基香兰素平均含量为2.014mg/kg和1.990mg/kg，测定结果的相对标准偏差分别为1.35%，1.57%。表明方法测量重复性良好。
2.7加标回收试验
取牛奶样品9份，每份为5g，每3份为一组，每组分别加入混合标准溶液4，5，6mL，按照1.3样品溶液的配制方法进行提取和定容后，按1.4色谱条件测定，测定结果见表3。由表3可知，实验所得香兰素、乙基香兰素平均加标回收率为99.8%，98.4%;测定结果的相对标准偏差分别为1.06%，2.31%。
