检测及试验方法
标准溶液的配制
(1)标准储备液：分别称取10.0mg的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准品，溶于乙腈，定容至100.0mL，得到浓度为100.0mg/L的标准贮备液。
(2)标准系列：取标准储备液用乙腈稀释配制成0.40μg/L、2.0μg/L、10.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、250.0μg/L的标准系列溶液，进样前用0.25μm微孔滤膜过滤。
分离检测条件
标准曲线
系列工作溶液，以浓度为横坐标，定量离子对峰面积为纵坐标，建立标准曲线，每个浓度测定3次，取平均值。苏丹红工作溶液放置避光处。
精密度
选取添加标准品(苏丹红Ⅰ~Ⅳ)50.0μg/L，重复测定6次，精密度以相对标准偏差RSD表示。
回收率
在小鼠血液中添加10.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L，高、中、低3个浓度的标准溶液，样品处理方法按“二、5”处理，计算回收率。
色谱分离条件的选择与优化
比较了ZORBAX SB-C8(4.6mm×50mm，3.5μm)和VARIAN Pursuit C18(150mm×4.6mm，5μm)两种色谱柱的分离情况。实验结果表明，选用150mm的VARIANPursuit C18柱，分离时间较长，苏丹红Ⅲ的出峰时间为35min，且未分离出苏丹红Ⅳ。而用ZORBAX SBC8柱，在8min内就能达到较好的分离效果。因此，本研究选择ZORBAX SB-C8色谱柱作为分离柱。
对于流动相的比例，参照相关文献的梯度洗脱程序进样检测的结果并不比单纯采用0.25%甲酸∶乙腈=20∶80等度洗脱的分离效果好，而且等梯度洗脱避免了梯度洗脱基线漂移以及耗时长的缺点。因此，本实验流动相中水相选择了0.25%的甲酸水溶液，有机相选择乙腈。水相与流动相比例为20∶80，色谱图如图1所示。
质谱条件的优化
本文选用电喷雾离子源正离子化方式对苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4种物质进行二级质谱分析，为了获得更高的离子强度，在MRM的模式下采用质谱方法自动优化软件对质谱条件进行优化，如表2所示。
标准曲线
将系列标准工作溶液按设置好的条件进行检测，采用外标法定量，以X轴表示样品浓度(μg/L)，Y轴表示定量离子对峰面积作标准曲线图，所得标准曲线的相关系数R2均大于0.99，如图2所示。
