利尿剂通常在一些病理状况下用作治疗药物以排出体内流体，其不仅能促使肾脏排泄水和盐，同时也影响肾脏吸收和排泄其它离子如钾、钙、镁等。由于其作用迅速、强大而短暂，被广泛地用于畜禽养殖中治疗严重心、肝、肾性各类水肿，预防急性肾功能衰竭和加速毒物排出。若饲养者未经授权使用或者未遵循使用说明使用，可能导致其通过肉、奶进入消费者体内，危害消费者身体健康。长期食用含有利尿剂残留的食物可能使尿中的盐和电解质过度流失，破坏体内电解质平衡，严重时还会导致心律不齐或心脏衰竭而危及生命。因此有必要监控利尿剂在禽肉和奶中的残留，以免消费者身体健康遭受危害。作为被批准用作奶牛养殖中治疗奶牛乳腺及相关水肿的4种利尿剂之一，氯噻嗪不仅具有利尿作用，而且还具有降压作用。我国农业部规定乳牛使用氯噻嗪的休药期为72h，但目前还没有规定氯噻嗪的容许量，FDA只有一个临时性的安全水平限，规定氯噻嗪在牛奶中的限量为67μg/kg。目前，利尿剂残留的检测主要面向饲料、人及动物尿液、保健食品等，方法有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱–质谱法、液相色谱–质谱法[1–9]。液相色谱–串联质谱法以其高灵敏度和可靠的确证性能，正得到越来越广泛的应用。生鲜乳样品含有大量的脂肪和蛋白，基质较为复杂，特别是前处理过程与一般样品差异较大。笔者采用液相色谱–串联质谱法测定生鲜乳中氯噻嗪残留量，为养殖环节利尿剂药物的监控及生鲜乳质量安全提供了技术保障。
1实验部分
1.1主要仪器与试剂
氯噻嗪标准储备液：100μg/mL，用甲醇配制，于冰箱中–20℃保存。根据需要用流动相将标准储备液稀释成适合浓度的标准工作溶液，现配现用;实验用水为Milli-Q去离子高纯水。
1.2样品前处理
取5mL生鲜乳样品至15mL离心管中，在4℃以2000r/min转速离心10min，去除上层脂肪。脱脂后的样品转移至50mL离心管中，加入10mL乙腈和2mL5%乙酸铅溶液涡旋混合沉淀蛋白，在4℃以5000r/min离心10min。取上清液至50mL离心管中，加入25mL水饱和的乙酸乙酯，涡旋混合，离心分层，有机相中加入5mL10%钨酸钠溶液，涡旋混合，离心分层，有机相在40℃下氮吹至近干，用流动相定容后过有机微孔滤膜，滤液供LC–MS/MS测定。
1.3仪器工作条件
1.3.1色谱条件
色谱柱：ZOBRAXSB–C18型(50mm×2.1mm，1.8μm);流动相：乙腈–0.1%甲酸溶液(体积比为30∶70)，流速为200μL/min;柱温：30℃;进样量：10μL。
1.3.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源(ESI);扫描方式：负离子扫描;检测方式：多反应监测(MRM);干燥气温度：350℃;干燥气流速：10L/min;雾化器压力：2.76×105Pa(40psi);毛细管电压：4000V。*佳的碰撞电压及定性离子对、定量离子对、保留时间及碰撞能量见表1。
2结果与讨论
2.1样品提取、净化条件
生鲜乳中主要含脂肪、蛋白质、氨基酸和碳水化合物等，成分复杂，前处理过程与一般样品差异较大。在进样前需要进行必要的净化处理，否则会干扰电喷雾过程的离子化程度，形成基质效应，从而影响测定结果的灵敏度和准确性。笔者在参考相关文献[1–9]的基础上，先在4℃下冷冻离心去除上层脂肪，再加入10mL乙腈和2mL5%乙酸铅溶液作为蛋白沉淀剂。选择乙酸乙酯作为提取剂，有机相在40℃下用氮气吹至近干，用流动相定容，过有机微孔滤膜后供液相色谱串联质谱仪分析。
以乙酸乙酯为提取剂进行冷冻离心，能较好地提取氯噻嗪，并去除干扰组分的影响。以空白样品提取液做质谱全扫描，未发现有较大的基质干扰峰，说明本方法无明显基质干扰，分析准确度高。
2.2色谱、质谱分析条件
由于氯噻嗪中含有多个*性基团，在一些色谱柱中会出现保留时间无规则的漂移。为了得到相对比较稳定的色谱保留时间，考察了AgilentZOBRAXSB–C18色谱柱，结果发现，氯噻嗪色谱峰形良好。另外，当流动相中添加0.1%的甲酸溶液时，氯噻嗪色谱峰形能得到进一步改善，离子化效率较高。对流动相流速进行考察，结果发现流速为0.2mL/min时离子化效率*高。液相色谱以0.2mL/min的流速将20.0μg/L的氯噻嗪标准溶液引入离子源，分别在正负离子模
式下进行工作，发现该化合物适合负离子模式，这是因为该化合物中含有羧基，更易于失去H+。在ES–条件下一级质谱分析得到[M–H]+分子离子峰，即选取m/z294.1为分子离子。再以20.0μg/L的标准溶液对质谱参数进一步优化，以获得*佳的质谱条件。分别在120，130，140，150eV的碰撞电压下对氯噻嗪的分子离子进行选择性监测，比较不同碰撞电压下分子离子的强度，确定氯噻嗪的*佳解离电压为140eV。在140eV的碰撞电压下，对分子离子进行二级质谱分析，比较不同碰撞能量对特征离子的影响，使特征离子强度达到*大，*终确定m/z179为定性离子，m/z214为定量离子，优化后的多反应监测条件见表1。在*佳实验条件下，氯噻嗪的总离子流色谱图、二级质谱图、空白样品总离子流图分别见图1～图3。
2.3方法的线性范围与定量限
在优化的测定条件下，配制一系列不同浓度的标准溶液进行测定。以目标物定量离子的峰面积(Y)对氯噻嗪浓度(X)绘制标准曲线。结果表明，在5～100μg/L范围内，氯噻嗪的质量浓度和定量离子的峰面积呈良好的线性关系，相关系数为0.999，线性方程为Y=42394X–34647，氯噻嗪的定量限(S/N=10)为5μg/L。
2.4方法的精密度与回收率
在生鲜乳阴性样品中加入适当浓度的氯噻嗪标准溶液，使加标量相当于10，50，100μg/kg，涡旋混合。每个添加水平按1.2和1.3的方法重复测定6次。实验测得方法的回收率为86%～105%，相对标准偏差(RSD)为3.8%～7.5%。方法的测量精密度和加标回收率见表2。
3结论
用液相色谱–串联质谱法测定生鲜乳中氯噻嗪残留量，对净化方法、色谱质谱条件进行了优化，该方法具有操作简便，定性、定量准确，重复性好和灵敏度高的特点。能满足生鲜乳中氯噻嗪残留量的检测要求，填补了国内检测方法空白，为今后制定相关检验标准提供了参考依据。
