组蛋白修饰的研究方法

百检网 2022-10-31

组蛋白修饰的研究方法细胞裂解通过免疫印迹来检测组蛋白修饰时可以用经SDS Laemmli样品缓冲液提取得到的全细胞裂解液。对于动物细胞株而言,离心得到的细胞可以直接在样品缓冲液中重悬并煮过后上样;然而需要注意的是,一些实验方案中还会推荐在提取步骤后对样品进行超声处理。除了碱性预处理步骤是可选的以外,真菌蛋白提取物可以用同样的方式来进行准备。


然而,如果实验上必须尽量减少样品处理时间的话该步骤是可以省略的。只要注明该步骤的省略以及后续实验样品均以同样方式处理即可。提取之后再通过离心除去样品中的不溶性组分,将可溶性的全细胞提取物留在上清中。


组蛋白富集在一些实际应用中,有必要检测富集有组蛋白的组分或纯化的组蛋白;富集的样品可以是分离得到的细胞核或者是染色质的粗提取物。从后生动物细胞或者酵母中提取细胞核十分简单,基本上只需要三个步骤:低渗膨胀(酵母要先将细胞壁消化掉以后)、利用机械力剪切进行细胞膜裂解(例如用杜恩斯匀浆器进行破碎或者在旋涡混合器上温和震荡)和通过离心分离细胞核。


染色质粗分离也是很简单的,只要在去垢剂裂解步骤后用离心将染色质沉淀即可。组蛋白纯化一些现有的组蛋白纯化实验方案是相当好的,并且易于遵循 [18]。在这里介绍的方法中,组蛋白是使用稀硫酸溶液从细胞核中提取的,然后通过柱层析纯化。此方法的优点在于核酸和许多非组蛋白由于在酸性pH值下是不溶的,可以很容易地通过离心来去除掉。可溶的含有组蛋白的组分就可以用 三氯乙酸(TCA)来沉淀,并且如果需要的话,可以通过一个反相高效液相色谱柱的方法来纯化。这样提取出来的组蛋白,可用于多种应用,包括免疫印迹和质谱。

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